官穎 孟立峰

糖尿病是一組以高血糖為主要特征的代謝性疾病，現(xiàn)已成為我國發(fā)病率最高的慢性疾病之一［1］。糖尿病患者由于長期血糖偏高，導(dǎo)致各種組織，尤其是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等器官的慢性損害，最終導(dǎo)致器官功能障礙，引發(fā)各類疾?。?］。糖尿病腎病在我國糖尿病患者中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前已成為終末期腎病的第二位原因。糖尿病腎病患者由于體內(nèi)存在復(fù)雜的代謝紊亂過程，一旦疾病發(fā)展至終末期，常較其他原因引起的腎臟疾病更嚴(yán)重。因此，加深對糖尿病腎病病理過程的研究有利于延緩糖尿病腎病的疾病進(jìn)程。腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-a，TNF-α）作為免疫細(xì)胞分泌的主要促炎因子可參與糖尿病腎病演變的全過程。而程序性壞死是受腫瘤壞死因子受體或模式識別受體所調(diào)控［3］。本研究通過高糖處理誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞（normal rat kidney epithelial cell line，NRK52E）程序性壞死的發(fā)生并闡明TNF-α 在NRK52E 程序性壞死過程中發(fā)揮的作用，加深大眾對于糖尿病誘導(dǎo)的糖尿病腎病病理過程的認(rèn)知。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠NRK52E 購自中科院上海細(xì)胞庫，用含有10%小牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 DMEM（high glucose）、FBS、0.05%胰酶/EDTA 均購自Gibco；無水葡萄糖購于索萊寶公司；Lenalidomide 購于中國selleck 公司；兔抗小鼠TNF-α、RIP1、RIP3 和MLKL 單克隆抗體均購于Abcam 公司；GAPDH 單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 均購于Bioworld 公司；MTS 檢測試劑盒購于伯信生物公司；細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒購于中國碧云天公司；TNF-α ELISA 檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 細(xì)胞活性測定 將NRK52E 以每孔5000 個細(xì)胞的濃度接種至96 孔板中。用不同濃度高糖溶液處理NRK52E，通過MTS 檢測試劑盒評估細(xì)胞活性。具體方法為：將MTS 染料加入每個細(xì)胞孔內(nèi)并孵育3h。通過評估490nm 處的吸光度來檢測細(xì)胞活性。為了實驗結(jié)果的一致性，將MTS 測定重復(fù)3 次。

1.4 細(xì)胞凋亡及壞死染色 將NRK52E 培養(yǎng)于六孔板內(nèi)，12h 后給予高糖和（或）TNF-α 抑制劑處理。繼續(xù)培養(yǎng)48h 后，緩慢吸去原有細(xì)胞培養(yǎng)基，向各孔內(nèi)加入1ml 細(xì)胞染色緩沖液、5μl Hoechst 染色液、5μl PI 染色液，混勻，4℃孵育30min，染色后用PBS 洗滌1 次，將六孔板置于熒光顯微鏡下觀察，觀察紅色熒光和藍(lán)色熒光強(qiáng)度，評估NRK52E 凋亡和壞死程度。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附雙聯(lián)抗體夾心法 將NRK52E 濃度調(diào)整為1×106/L，取1ml 細(xì)胞懸液接種于24 孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12h，12h 后給予高糖和（或）TNF-α 抑制劑處理，繼續(xù)培養(yǎng)48h 后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)基，在12000r/min 的速度下常溫離心20min，將細(xì)胞上清液收集于EP 管中，并凍存于-20℃冰箱備用。實驗時取出EP 管，迅速復(fù)溶后嚴(yán)格按 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀450nm 處讀取吸光度值，并按照各自標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞上清液中TNF-α 含量值。

1.6 Western blot 法 檢 測TNF-α、RIP1、RIP3 和MLKL 的蛋白表達(dá)水平 將NRK52E 置于PBS 液中洗滌3 次，添加細(xì)胞裂解液后置于冰上反應(yīng)30min，在12000r/min 的速度下冷凍離心20min，收集上清液后應(yīng)用BCA 法定量蛋白。經(jīng)凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST 洗膜后分別加一抗GAPDH（1 ∶5000）、RIP1（1 ∶1000）、RIP3（1 ∶1000）、MLKL（1 ∶1000） 和TNF-α（1 ∶1000），4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2h，TBST 洗膜3 次后用ECL試 劑 顯 影 曝 光。TNF-α、RIP1、RIP3 和MLKL 以GAPDH 蛋白條帶作為參照，通過Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描，ImageLab 圖像軟件定量分析每個條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni 校正的t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探究含不同濃度葡萄糖的DMEM 高糖培養(yǎng)基對NRK52E 活性的影響 MTS 實驗結(jié)果表明，給予含低濃度葡萄糖的DMEM 高糖培養(yǎng)基處理后，NRK52E 的活性無明顯改變，隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低。在給予含30、60mmol/L 葡萄糖的DMEM 高糖培養(yǎng)基處理后，NRK52E 活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖1）。因此，在本研究通過給予含30mmol/L 葡萄糖的DMEM 高糖培養(yǎng)基處理NRK52E 構(gòu)建糖尿病腎病細(xì)胞模型。

圖1 不同濃度葡萄糖處理對于腎小管上皮細(xì)胞活性的影響

2.2 高糖培養(yǎng)基可誘導(dǎo)NRK52E 壞死和凋亡改變 為了探究高糖培養(yǎng)基對NRK52E 的損傷作用，本研究通過凋亡和壞死染色試劑盒對細(xì)胞進(jìn)行染色。熒光染色結(jié)果表明正常對照組細(xì)胞無明顯異常（弱紅色與弱藍(lán)色熒光）；而給予高糖處理后，NRK52E 出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡（弱紅色熒光、強(qiáng)藍(lán)色熒光）及壞死（強(qiáng)紅色熒光、強(qiáng)藍(lán)色熒光）。

2.3 高糖培養(yǎng)基可誘導(dǎo)NRK52E 程序性壞死相關(guān)蛋白表達(dá)水平的上調(diào) Western blot 檢測結(jié)果表明，與正常對照組比較，給予高糖培養(yǎng)基處理后NRK52E 內(nèi)程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05，見圖2）。

2.4 高糖培養(yǎng)基可誘導(dǎo)NRK52E 上清液中及細(xì)胞內(nèi)TNF-α 蛋白表達(dá)水平的上調(diào) ELISA 實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，給予高糖培養(yǎng)基處理后NRK52E上清液中TNF-α 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05，見圖3）；western blot 檢測結(jié)果表明，與正常對照組比較，給予高糖培養(yǎng)基處理后NRK52E 內(nèi)TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05，見圖3）。

圖2 高糖培養(yǎng)基對于腎小管上皮細(xì)胞程序性壞死蛋白RIPI、RIP3和MLKL表達(dá)水平的影響

圖3 高糖培養(yǎng)基對于細(xì)胞上清液和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響

2.5 TNF-α 抑制劑處理可下調(diào)高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的NRK52E 程序性壞死 Western blot 檢測結(jié)果表明，與糖尿病腎病組比較，給予TNF-α 抑制劑處理可顯著抑制高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的NRK52E 內(nèi)程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表達(dá)水平的上調(diào)（P＜0.05，見圖4）。

圖5 TNF-α抑制劑對于腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)RIPI、RIP3和MLKL蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

糖尿病腎病是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，其主要特征為腎小球肥大和細(xì)胞外基質(zhì)堆積，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球纖維化，最終引起腎功能不全［4］。本研究通過體外實驗構(gòu)建糖尿病腎病細(xì)胞模型從而明確糖尿病腎病的疾病過程，結(jié)果表明TNF-α 誘導(dǎo)的程序性壞死在糖尿病腎病的疾病過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

已有大量研究結(jié)果表明，程序性壞死在不同疾病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，Jun 等［5］的研究表明，程序性壞死可作為腦中風(fēng)新的治療靶點。Wang 等［6］的研究表明，通過藥物抑制程序性壞死進(jìn)程可以有效治療脊髓損傷。Coornaert 等［7］的研究表明，通過抑制程序性壞死可以有效延緩動脈粥樣硬化的形成。程序性壞死這種新的死亡模式需要受體相互作用蛋白激酶RIP1、RIP3 和MLKL 的參與，兩者通過結(jié)合區(qū)相互結(jié)合形成誘導(dǎo)死亡信號復(fù)合體，從而促進(jìn)細(xì)胞程序性壞死。本實驗通過檢測NRK52E 內(nèi)程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表達(dá)水平，從而明確NRK52E 程序性壞死嚴(yán)重程度。該研究結(jié)果表明程序性壞死在糖尿病腎病的演變過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

有研究表明TNF-α 可通過作用于TNFR 受體激活細(xì)胞內(nèi)程序性壞死過程［8］。在本實驗中，作者通過多種生物學(xué)實驗檢測細(xì)胞上清液中和細(xì)胞內(nèi)TNF-α 表達(dá)水平，結(jié)果表明TNF-α 表達(dá)水平顯著上調(diào)。在給予高糖培養(yǎng)基處理的NRK52ETNF-α 抑制劑處理后，細(xì)胞內(nèi)程序性壞死相關(guān)蛋白RIP1、RIP3 和MLKL 表達(dá)水平顯著降低。這一實驗結(jié)果表明TNF-α 在高糖誘導(dǎo)的NRK52E 程序性壞死過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在給予NRK52E 高糖培養(yǎng)基處理后，細(xì)胞上清液中和細(xì)胞內(nèi)炎癥因子TNF-α表達(dá)水平以及細(xì)胞內(nèi)程序性壞死相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。在給予NRK52ETNF-α 抑制劑處理后細(xì)胞內(nèi)程序性壞死相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。結(jié)果表明TNF-α 可通過調(diào)控NRK52E 程序性壞死過程促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的NRK52E 損傷，本研究結(jié)果為糖尿病腎病治療新的靶點提供了理論依據(jù)。