文/ 李世燕

單克隆抗體下游純化步驟一般包括親和捕獲、低pH 病毒滅活、中度純化、精細(xì)純化、除病毒過濾、超濾換液——其中，由于除病毒過濾器的價(jià)格昂貴和一次性使用的特性，導(dǎo)致除病毒過濾占用了整個(gè)生產(chǎn)工藝的很大一部分成本。因此，優(yōu)化除病毒過濾器的載量顯得格外重要。如今，白帆生物已經(jīng)完成了2 個(gè)項(xiàng)目的工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，這兩個(gè)項(xiàng)目都著重提高了除病毒過濾器的載量，且兩個(gè)項(xiàng)目即將進(jìn)行2 000 L 的生產(chǎn)。本文從白帆生物優(yōu)化除病毒過濾器載量經(jīng)驗(yàn)而來。

現(xiàn)行法規(guī)要求在生物制藥制造過程中至少使用2 種不同的方法去除病毒[1]，我們常用的病毒去除/滅活的方法就是除病毒過濾和低pH 病毒滅活法。低pH 病毒滅活法主要滅活脂包膜病毒。而非清除脂包膜病毒，如小白鼠病毒（MMV），通常通過物理方法實(shí)現(xiàn)分離，因?yàn)槠鋵瘜W(xué)失活具有很高的抵抗力，因此需要除病毒濾膜來去除在生物制藥產(chǎn)品的純化過程中產(chǎn)生的非脂包膜病毒。除病毒過濾濾膜既可以去除非脂包膜病毒，也可以去除脂包膜病毒。

除病毒濾膜為死端過濾，截留大于孔徑的病毒顆粒，一般對于小于170 kDa 的蛋白產(chǎn)品，回收率大于98%。在病毒過濾過程中，常常有各種因素可能會(huì)導(dǎo)致過濾通量降低、濾器載量降低。本文探討了從濾器選擇、樣品pH與電導(dǎo)優(yōu)化、樣品濃度選擇和添加劑選擇共4 個(gè)方面來優(yōu)化濾器的載量，以達(dá)到降低生產(chǎn)成本、節(jié)省過濾時(shí)間的目的。

圖 1 不同材質(zhì)濾器過濾某一蛋白的載量

濾器選擇

不同廠家的濾器材質(zhì)不同，適合的蛋白產(chǎn)品也不同。現(xiàn)有濾器材質(zhì)一般分為3 類：PES、PVDF 和中空纖維素。在實(shí)驗(yàn)中，分別使用這3 種材質(zhì)的濾器過濾相同蛋白，且蛋白濃度相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同材質(zhì)之間的過濾載量差別巨大[2]。如圖1 所示，中空纖維素膜載量＞PES 膜＞PVDF 膜，就此蛋白樣品而言，使用中空纖維素膜材質(zhì)的濾器最合適。但若換了其他不同性質(zhì)的蛋白，結(jié)果可能就完全相反，因此，需針對不同蛋白樣品選擇不同的濾膜材質(zhì)。

圖 2 某樣品在不同pH 條件下的過濾載量

樣品pH 與電導(dǎo)率優(yōu)化

樣品的pH 和電導(dǎo)率都有可能對除病毒濾器載量造成影響。如圖2 案例所示，對同一單抗產(chǎn)品使用相同濾器進(jìn)行過濾，樣品濃度一致，分別在pH 為4.3 和5.3的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果前者的過濾載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于后者。電導(dǎo)率也同樣能對除病毒濾器造成如此大的影響。因此，需從實(shí)際出發(fā)，對最適pH、電導(dǎo)率進(jìn)行考察以降低成本。

圖 3 某樣品在不同濃度下的過濾通量

樣品濃度選擇

生產(chǎn)過程中，在需要的蛋白量相同的情況下，蛋白濃度越高，樣品體積就越小，需要的儲(chǔ)液袋、儲(chǔ)液罐體積就越小，工藝時(shí)間也會(huì)縮短，因此工藝都在往高濃度方向發(fā)展。一般情況下，較高的蛋白濃度會(huì)導(dǎo)致較低的過濾速率。如圖3 所示，蛋白濃度為10.25 mg/mL 的通量從220 LMH迅速降低至10 LMH，而濃度為6.895 mg/mL 的蛋白樣品在此時(shí)仍有150 LMH 的通量。由此可見，就此工藝而言，樣品濃度為7 mg/mL 左右時(shí)過濾載量較優(yōu)。若想找到最優(yōu)范圍，仍需選擇其他濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因此，除病毒過濾需要結(jié)合工藝時(shí)間、成本等因素找到合適的濃度范圍，優(yōu)化性價(jià)比。

圖 4 Viresolve? Pro Micro Shield H 和Viresolve? Pro Micro Shield 適合的pH和電導(dǎo)率

添加劑選擇

若蛋白樣品不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生聚體，這會(huì)很大程度地影響除病毒濾器載量。我們可以通過添加氨基酸（精氨酸、組氨酸等）、糖類或者表面活性劑來穩(wěn)定蛋白，從而提高濾器載量。

預(yù)過濾器的選擇

預(yù)過濾濾器對納濾過濾器的性能有很大的影響，使用得當(dāng)可以明顯地減少納濾過濾器面積的使用。預(yù)過濾的目的是去除各種雜質(zhì)、污染物，如蛋白質(zhì)聚集物、DNA 和其他微量物質(zhì)。不同的預(yù)過濾器處理的料液不同。如圖4 所示，Viresolve?Pro Micro Shield H 適合處理高pH、高電導(dǎo)率的樣品，而Viresolve?Pro Micro Shield 適合處理低pH、低電導(dǎo)率的樣品[3]。

預(yù)過濾器的面積大小也會(huì)對除病毒濾器載量造成很大的影響，越大的預(yù)過濾器面積會(huì)使除病毒濾器載量越大。如圖5 所示，預(yù)過濾與除病毒濾器比例為4:1 時(shí)，通量明顯大于比例為1:1 時(shí)。結(jié)合濾器價(jià)格分析，若選擇比例為4:1 時(shí)增加的預(yù)過濾器價(jià)格低于選擇比例為1:1 時(shí)除病毒濾器增加的價(jià)格，則可考慮選擇4:1 的比例進(jìn)行除病毒過濾。

圖 5 預(yù)過濾器比例對某蛋白過濾載量的影響

圖6 白帆生物生產(chǎn)車間目前有2 條2 000 L 一次性生產(chǎn)線，未來可達(dá)6×2 000 L

總結(jié)

在本文中，我們探討了影響除病毒過濾器載量的不同因素，也分別舉了幾個(gè)例子來展示這些因素對載量可能的影響，從這些例子中我們可以看出濾器、樣品pH、電導(dǎo)率、樣品濃度、添加劑、預(yù)過濾器的不同都會(huì)對除病毒過濾造成不同的影響。若要使生產(chǎn)過程中除病毒過濾工藝成本最低，需綜合考慮各個(gè)因素的相互影響。

白帆生物生產(chǎn)車間目前有2條2 000 L 一次性生產(chǎn)線，未來可達(dá)6×2 000 L，如圖6 所示。除病毒過濾階段擁有Sartorius 的FlexAct VI 和FlexAct VR 兩臺設(shè)備，能全自動(dòng)地進(jìn)行低pH 病毒滅活和除病毒過濾操作。一次性的自動(dòng)化操作單元，大大降低了污染風(fēng)險(xiǎn)，減少了樣品在不利環(huán)境中的暴露時(shí)間和不必要的清潔驗(yàn)證，使得除病毒過濾操作更快速、安全、高效。

作為國內(nèi)一次性使用技術(shù)與商業(yè)生產(chǎn)及CDMO 服務(wù)結(jié)合的時(shí)代領(lǐng)軍者，白帆生物與Cytiva和Satorius 等國際企業(yè)強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，將“NONCROS 無交叉抗體工廠”的概念變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，引入現(xiàn)代化一次性使用系統(tǒng)生產(chǎn)線，建立了上海最大的單抗生產(chǎn)基地之一。該基地除了滿足集團(tuán)內(nèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)需求，也致力于為同行提供單抗CDMO 服務(wù)，謀求共同發(fā)展。