田暉艷，劉 羽，黃姣祺，謝鳳欣，黃國榮，廖 璞，府偉靈，張 陽

1. 陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，重慶 4000382. 重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，重慶 400030

1 拉曼光譜技術及其生物醫(yī)學應用

1928年印度科學家Raman首次發(fā)現(xiàn)拉曼散射效應，該效應產(chǎn)生的拉曼光譜是一種散射光譜，當單色光束的光子與生物分子相互作用時，可發(fā)生彈性碰撞及非彈性碰撞； 其中，彈性碰撞所產(chǎn)生的光散射被稱為瑞利散射，該碰撞過程僅改變了光子的運動方向而不改變頻率； 而在非彈性碰撞過程中，光子與分子之間發(fā)生能量交換，光子的運動方向及頻率均發(fā)生改變，這種非彈性散射稱為拉曼散射。拉曼散射光譜反應了特征峰的數(shù)量、強度、峰寬和位移等信息，這些豐富的譜峰信息均與待測物質的分子振動和轉動能級密切相關，因此，每種物質都有其特征拉曼光譜，通過檢測得到的拉曼光譜與數(shù)據(jù)庫中的拉曼光譜進行比對，便可得到待測物質的組成信息,從而達到定性分析的目的。此外，利用拉曼特征峰強度與待測物質濃度成正比的關系，可以達到半定量分析的目的。

核酸是以核苷酸為合成單位形成的生物大分子化合物，是生命最基本的遺傳物質，在生命體生長、遺傳、進化等一系列重大生命現(xiàn)象中占據(jù)著決定性作用。開展核酸分子診斷對促進人類健康醫(yī)療的發(fā)展具有重要意義。拉曼光譜技術在核酸等生物樣本的檢測與分析方面具有獨特的技術優(yōu)勢： (1)對待測樣本的形狀、大小要求低，可以省去復雜的樣本預處理環(huán)節(jié)； (2)樣本需求量少，適用于微量及痕量樣本的檢測； (3)可實現(xiàn)快速檢測，一般在30 s內(nèi)即可完成對一個樣本的檢測； (4)通過拉曼標簽技術的引入可以達到強特異性檢測的目的； (5)由于水的拉曼散射很微弱，使得拉曼光譜技術非常適用于水環(huán)境中樣本的檢測。因此，SERS光譜非常適合于多元生物樣本的檢測。

2 表面增強拉曼散射技術(SERS)

2.1 表面增強拉曼散射光譜的發(fā)現(xiàn)

拉曼光譜作為一種無損、非接觸式且可重復的快速檢測技術，能夠提供分子結構振動的指紋圖譜信息且譜峰窄不易發(fā)生重疊，在生化物質檢測中具有顯著優(yōu)勢。但拉曼光譜因其散射截面只有10～30 cm2/分子(約為紅外的10-6，熒光光譜的10-14)且容易受到熒光干擾[1]，限制了拉曼光譜的廣泛應用。20世紀70年代，F(xiàn)leischmann小組研究發(fā)現(xiàn)，將吡啶吸附在粗糙的銀表面時，可獲得高強度的拉曼光譜信號[2]。在隨后的研究中，Van Duyne及Creighton等證實了粗糙銀表面對吡啶分子的拉曼信號放大程度可達105～106倍，并將這一粗糙金屬表面的增強效應命名為表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering,SERS)[3]。20世紀末，Nie小組及Kneipp等先后研究報道了SERS在單分子及單納米粒子中的檢測，其拉曼信號增強因子可達1014 [4-5]。

2.2 SERS增強原理

在眾多的SERS增強機理研究中，物理增強機理和化學增強機理是目前被普遍接受的兩種解釋機理(如圖1所示)。其中，物理增強又稱為電磁場增強(electromagnetic enhancement,EM)，即電磁波與比波長小得多的等離子體(如Au、Ag)納米結構的相互作用會引起金屬表面自由電子的集體振蕩； 當入射光的頻率與金屬中自由電子固有的振蕩頻率相匹配時，局域表面等離激元共振(LSPR)就會發(fā)生，從而導致入射光場的增強，研究表明電磁場增強的增強因子可達1011左右[6]?；瘜W增強(chemical enhancement)是一種電荷轉移增強[7]，需要分析物直接吸附或通過化學鍵結合在粗糙金屬表面，并與金屬表面存在電荷轉移，當入射光子的能量與電子在金屬基底及吸附物之間的轉移能量差相等時將產(chǎn)生共振，從而使體系的有效極化率增加并使拉曼信號增強，研究表明化學增強因子為101～103左右[8]。通常認為SERS效應的產(chǎn)生是由上述兩種增強機理共同作用的結果。此外，Michaels小組研究發(fā)現(xiàn)在金屬納米結構的連接點及空隙處，SERS增強因子最大，這是因為當金屬納米顆粒相互靠近形成聚集時躍遷偶極分子相互耦合，在顆粒的結合處能獲得顯著增強的SERS效應[9]，這些特殊的增強位點被稱為SERS“熱點”。目前，大量對SERS金屬基底的選擇研究顯示，Au、Ag納米結構因具備較好的穩(wěn)定性、重復性且極易制取，成為研究者們對SERS基底的首選，并且，具備各向異性及尖銳形態(tài)的納米顆粒(如錐形、納米棒、納米星等)較對稱形(如球形)納米顆粒的SERS增強效果更好[10]。

圖1 SERS原理示意圖

3 基于SERS的核酸檢測技術類型及應用

核酸的特異性檢測是臨床檢驗醫(yī)學的重要研究內(nèi)容，在疾病的診斷及治療方面具有非常重要的應用價值。常見的基于SERS的核酸檢測技術，根據(jù)是否使用探針標記物，可分為無標記檢測(Label-free SERS)及標記型檢測(SERS tags)兩種類型(如圖2所示)。

圖2 SERS無標記檢測(左)及標記型檢測(右)技術原理示意圖

3.1 無標記檢測

在無標記檢測方法中，待測樣本直接吸附于金屬納米結構表面，利用SERS技術直接獲取生物樣本自身的拉曼指紋圖譜，該方法需要結合特殊的納米基底結構及光譜分析技術，用于區(qū)分不同狀態(tài)下的生物分子或不同物種的細胞、微生物的光譜信息[11]； ElSayed等利用高濃度的球形納米銀膠體顆粒聚集后形成的SERS“熱點”效應，研究了癌細胞DNA發(fā)生構想變化而形成的拉曼特征峰，實現(xiàn)了對癌細胞DNA和健康細胞DNA高重現(xiàn)性的分辨[12]。Abell等設計了一種以Ag納米棒為結構單元的微陣列芯片，以此來研究miRNA序列中嘌呤及嘧啶的相對比率，并通過最小二乘法分析成功實現(xiàn)了miRNA捕獲雜交前后拉曼光譜的特征差異探究[13]。無標記SERS核酸檢測技術的優(yōu)點在于步驟簡單，無需對樣本進行特殊處理，但總體而言，該方法尚未能滿足臨床實際檢測對靈敏度及特異性的要求。

表1 SERS無標記檢測及標記型檢測方法分析Table 1 Analysis of the label-free SERS approach and SERS tags-based nucleic acid assays

3.2 標記型檢測

標記型檢測方法通常依賴拉曼報告分子修飾的金屬納米顆粒，通過檢測拉曼報告分子強烈而獨特的拉曼信號達到檢測目的[14-15]。當前，基于SERS標記型檢測技術的核酸檢測方法，主要包括： “夾心法”、“信號開關法”及鏈式雜交反應(hybridization chain reaction,HCR)引起的信號放大。其中，“夾心法”檢測策略靈敏度高，具有良好的定量檢測能力，可應用于多元檢測，是開展SERS標記型檢測DNA/RNA最常用的方法。

3.2.1 “夾心法”檢測

“夾心法”SERS探針檢測結構一般由納米金屬核、拉曼活性分子、DNA探針鏈及封閉液構成(如圖3所示)。其中，金屬核在SERS探針中用作增強基底，是保證SERS探針實現(xiàn)高性能檢測的關鍵之一。金、銀膠體溶液因制備簡單、易于保存、表面增強效果好等優(yōu)勢在SERS探針金屬核的應用最為廣泛； 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，相同實驗條件下，納米金顆粒的表面增強能力較納米銀弱10～100倍[16]。在金屬核的結構及形貌方面，伴隨著納米材料制備技術的迅猛發(fā)展，不拘于早期的單一球形金屬納米顆粒，現(xiàn)已成熟應用的還有納米棒、多面體形、星形、樹枝形和花形等； 此外，新型的合金或核殼雙金屬復合納米粒子也越來越多地應用于SERS探針金屬核，如金核銀殼、銀核金殼等。拉曼活性分子可通過綁定在金屬核表面來實現(xiàn)拉曼信號的輸出功能； 常用的拉曼活性分子可大致分為三類： 含氮陽離子染料(如結晶紫、羅丹明6G等)、含硫染料(如孔雀石綠)以及硫代小分子(如4-氨基苯硫酚、4-甲基苯硫酚等)[17]。DNA探針鏈是保證實現(xiàn)SERS探針特異性靶向識別檢測目標序列的關鍵，將DNA探針鏈在金屬核表面的固定方法主要有兩種： 一是通過巰基形成S-金屬共價鍵，以及通過氨基和羧基縮合形成酰胺鍵，從而將DNA探針有序組裝到金屬核表面。

此外，為了保證上述SERS探針的結構穩(wěn)定性及特異性檢測，通常需要對SERS探針結構外表面進行封閉，常用的封閉液有BSA和MCH等。Zhou等[19]在構建“夾心”SERS標簽的基礎上，研制了一種以細菌為模板的Ag微球作為信號放大基底，如圖4所示，該方法設計了3種分別結合了不同拉曼信號分子(44DP，4-ATP，DTNB)的“夾心”SERS標簽，通過捕獲探針將SERS標簽結合在Ag微球表面，通過對SERS標簽的檢測可達到同時檢測3種肝癌腫瘤標志物miRNA-21，miRNA-122，miRNA-223的目的。從SERS光譜檢測結果圖中顯示： 該方法在具有較高靈敏度與特異性的同時，成功實現(xiàn)了多個腫瘤標志物的高通量檢測。

圖3 “夾心法”SERS核酸檢測結構示意圖[18]Fig.3 Scheme of SERS-based nucleic acid detectionbased on sandwich structure[18]

Li等[20]以銀納米粒為核標記探針拉曼分子并包裹二氧化硅殼(Ag nanorice @ MGITC @ SiO2)作為SERS 探針，利用光刻技術在硅圓片上形成三角狀金納米膜作為SERS活性檢測基底，實現(xiàn)了乙型肝炎病毒DNA的檢測，檢測限達到50 amol·L-1。Kang等[21]在直徑約為150 nm的金納米棒上構建檢測基底，與球形金納米顆粒探針一起實現(xiàn)了對復合病原體DNA的檢測，檢測限達到10 pmol·L-1。Liu等[22]通過合成寡核苷酸修飾的Ag納米結構為增強基底，并采用DTNB、4-MBA標記、并用寡核苷酸修飾的Au納米粒子作為SERS標簽，直接在水溶液中進行DNA檢測，實驗結果顯示目標DNA濃度在10-11～10-8mol·L-1范圍時，目標DNA的濃度對數(shù)與SERS信號強度呈現(xiàn)良好的線性關系，此實驗方法可與固相檢測方法的靈敏度相媲美。

3.2.2 信號開關法

“信號開關法”一般是通過分子探針與目標序列的結合實現(xiàn)。如圖5所示，根據(jù)目標DNA/RNA序列針對性地設計與目標序列結合過程中可發(fā)生可逆性解離、聚合的發(fā)夾型DNA探針鏈，在探針鏈的兩端分別標記上固定基團(如巰基)和拉曼活性分子，探針鏈通過固定基團組裝到SERS活性基底表面，從而成功構建發(fā)夾型SERS檢測探針。該發(fā)夾型探針要求探針鏈含有與目標DNA/RNA序列完全互補的環(huán)狀序列，通過與目標DNA/RNA序列的結合實現(xiàn)環(huán)鏈的打開，拉曼活性分子遠離基底表面，從而使SERS信號強度發(fā)生變化[23]。

Song等[24]采用發(fā)夾型SERS檢測探針同時檢測3種肺癌miRNA標志物(miRNA 21，miRNA 486，miRNA 375)，如圖6(a)，通過設計與目標miRNA完全互補的3種發(fā)夾型SERS檢測探針，并將探針吸附結合于銀納米棒微陣列基板上。當目標miRNAs存在時，發(fā)夾探針環(huán)序列打開，拉曼活性分子遠離銀基底表面，SERS信號由“ON”到“OFF”，信號強度顯著降低。通過監(jiān)測SERS信號值的變化達到定量檢測血清中目標miRNAs的目的。實驗結果顯示： 利用該方法檢測人血清中miRNAs的LOD值為： miRNA 21/393 amol·L-1，miRNA 486/176amol·L-1，miRNA 375/144 amol·L-1。

在另一項分析中，Wang等[25]開發(fā)了一個SERS信號由“OFF”到“ON”的信號開關，他們稱之為“反向分子哨兵(inverse molecular sentinel,iMS)”納米探針，以區(qū)別于之前的“ON”到“OFF”開關。如圖6(b)，在此項研究中，以一條單鏈DNA作為“占位”鏈與納米探針的莖環(huán)序列雜交，發(fā)夾探針的環(huán)序列打開，從而使拉曼報告分子遠離金屬納米顆粒表面； 當目標序列出現(xiàn)時，占位DNA鏈與納米探針序列解離，探針序列重新形成發(fā)夾型結構，拉曼報告分子移動到金屬納米顆粒表面，從而產(chǎn)生強烈的SERS信號，從圖6(b)中的SERS光譜圖可以看出，譜線b(樣本組)呈現(xiàn)出的SERS信號遠高于譜線a(空白對照組)，從而佐證了該方法的可行性。

3.2.3 HCR信號放大法

鏈式雜交反應(hybridization chain reaction,HCR)是一種在室溫條件下進行的無酶、線性擴增方法。在HCR反應的溶液中存在著穩(wěn)定的DNA發(fā)夾探針，觸發(fā)鏈的進入可引發(fā)一系列的雜交反應，最終形成雙螺旋DNA聚合物。HCR信號放大聯(lián)合SERS檢測的方法是在DNA聚合物上連接由拉曼活性分子包被的金屬納米顆粒，由金屬納米顆粒形成的“熱點”效應可顯著實現(xiàn)拉曼信號放大并最終達到定量檢測靶序列的目的。

與酶促擴增檢測法相比，HCR反應操作簡單且成本更低，僅靠單鏈DNA即可實現(xiàn)雙鏈DNA聚合物大小的原位調(diào)節(jié)。Li等[26]設計了一種以靶序列為觸發(fā)鏈的HCR信號放大聯(lián)合SERS檢測miRNA-141的方法，如圖7(a)所示，該方案中的捕獲探針由捕獲鏈、Au納米顆粒及拉曼信號分子構成，由靶序列miRNA-141觸發(fā)形成的雙鏈DNA聚合物通過納米磁珠產(chǎn)生聚集后，捕獲探針通過捕獲鏈特異性結合DNA聚合物上的粘性末端，使得Au納米顆粒在聚合物上形成“熱點” 效應，通過檢測放大后的拉曼信號達到定量檢測復雜生物樣本中miRNA-141的目的。實驗結果顯示，利用該方法檢測乳腺癌細胞中miRNA-141，其線性有效檢測范圍為10-15～10-7mol，LOD值可達0.17 fmol·L-1。

圖6 (a)一種用于高通量檢測miRNAs的功能化發(fā)夾探針SERS傳感器原理圖[24]； (b)SERS“反向分子哨兵(IMS)”納米探針檢測原理圖[25]Fig.6 (a) Schematic illustration of the molecular beacons functionalized-SERS sensor for simultaneously measuringmultiple miRNAs[24]; (b) Detection scheme of the SERS “inverse Molecular Sentinel” nanoprobes[25]

圖7 HCR信號放大SERS核酸檢測示例圖[26-27]Fig.7 Scheme of SERS-based nucleic acid detection based on the signal amplification of hybridization chain reaction[26-27]

在后續(xù)的研究中，Liu等[27]采用HCR聯(lián)合銀納米顆粒形成的“熱點”效應，如圖7(b)，在微陣列硅基片上成功實現(xiàn)了單細胞的miRNA-21檢測，如圖7所示，該方案采用DBDT(4,4’-biphenyldithiol)作為拉曼信號分子并連接形成間隔距離為1 nm的AgNP二聚體，從而產(chǎn)生典型的SERS “熱點”； 當修飾有捕獲鏈的硅基片上引入靶序列miRNA-21后，發(fā)生的一系列HCR反應將大量AgNP富集，從而產(chǎn)生超強拉曼信號； 實驗結果顯示，該方法特異性好，對單堿基突變及雙堿基突變序列的檢測信號點分別僅為12.4%和4.6%(定義對靶序列miRNA-21的檢測信號點100%)。

4 與SERS技術聯(lián)用的核酸檢測方法

4.1 SERS聯(lián)合PCR核酸檢測方法

基于聚合酶鏈式反應(PCR)的SERS技術主要是目標DNA片段的PCR擴增產(chǎn)物與SERS探針結合，在激光照射下產(chǎn)生SERS信號，根據(jù)SERS光譜實現(xiàn)DNA檢測。He等[28]利用RCA擴增技術及SERS信號開關技術建立了一種miRNA超靈敏檢測方法，在磁性納米顆粒上連接功能性發(fā)夾探針，發(fā)夾探針一端連接納米金顆粒； 原始狀態(tài)下，磁性納米顆粒上的發(fā)夾探針通過與占位DNA鏈的結合-環(huán)鏈打開，Cy5遠離磁性納米顆粒，拉曼信號弱，信號開關處于閉合狀態(tài)； 通過引入RCA擴增產(chǎn)生的DNA觸發(fā)鏈后，該觸發(fā)鏈競爭性結合占位DNA鏈，發(fā)夾探針的形成環(huán)序列，拉曼活性分子靠近磁性納米顆粒并在SERS效應的影響下產(chǎn)生強烈的拉曼信號，從而達到超靈敏檢測miRNA-150的目的。實驗結果顯示： 此檢測方法的LOD值為70.2 amol·L-1,有效線性檢測范圍為100 amol·L-1～100 pmol·L-1。SERS聯(lián)合PCR核酸檢測方法在微量檢測及樣本處理方面具有諸多優(yōu)勢，通過PCR技術可以成功實現(xiàn)對靶序列的重組及濃度放大，從而達到超靈敏檢測的目的。

4.2 SERS聯(lián)合酶切技術的核酸檢測方法

基于酶切技術的核酸SERS檢測主要是借助金屬納米顆粒之間“熱點”的優(yōu)異SERS增強性能，利用ss-DNA的自組裝增加熱點形成的概率，利用酶切反應進行熱點消除，來實現(xiàn)SERS信號從弱到強再從強到弱的變化。Crew等[29]在包被了拉曼活性分子的金納米顆粒之間設計并連接了一條30 bp的DNA雙鏈，通過DNA雙鏈連接形成的金納米顆粒多聚體形成了大量SERS“熱點”，可產(chǎn)生較強的SERS信號； 當限制性內(nèi)切酶作用于DNA雙鏈時，“熱點”消失，SERS信號顯著減弱，由此根據(jù)SERS信號的變化可以實現(xiàn)對DNA雜交及限制性酶切過程的檢測。SERS聯(lián)合酶切技術的核酸檢測方法可成功實現(xiàn)在液相環(huán)境中的DNA組裝及核酸有效檢測，充分發(fā)揮了金屬納米顆粒之間SERS“熱點”的優(yōu)勢，達到高靈敏檢測的目的。該研究清楚地驗證了DNA自組裝及酶切反應在SERS“熱點效應”形成過程中的能力，這對于制定新的生物分析策略具有重要意義。

關于SERS技術在核酸檢測中的應用研究主要集中在不同SERS增強基底、不同靶標捕獲方式、不同信號放大方式等方面，基底功能化、多種拉曼報告分子形成多元檢測、“熱點效應”的產(chǎn)生及減弱已成為SERS核酸檢測的主要趨勢，表2為SERS技術在核酸檢測中的應用。

表2 SERS在核酸檢測中的應用Table 2 Typical research about SERS used for detection on nucleic acids

5 SERS技術走向臨床應用的技術發(fā)展方向

SERS技術作為一種新興的快速檢測方法，因其特有的指紋圖譜、無損性、高靈敏度、操作簡單且不受水干擾等技術優(yōu)勢，已成為核酸檢測領域近年來的研究熱點。然而，SERS技術在臨床應用方面仍然存在著諸多挑戰(zhàn)： (1)大規(guī)模生產(chǎn)重現(xiàn)性能好、可長期穩(wěn)定儲存的高靈敏度SERS探針較難實現(xiàn)，目前常用的Au和Ag納米顆粒在溶液中極易產(chǎn)生聚集，并且拉曼活性分子與納米顆粒的結合穩(wěn)定性差，因此，對SERS探針表面結構的涂層保護非常重要； (2)為了準確實現(xiàn)對生物樣本中各種循環(huán)標志物濃度檢測，必須首先獲得可信的定量檢測標準曲線，但由于生物樣本自身的成分復雜，對SERS檢測信號的干擾因素較多，使得對臨床樣本的準確定量檢測較難成功實現(xiàn)； (3)研制高靈敏度、易操作、低成本的拉曼光譜儀是將SERS技術轉化為實際應用的關鍵。我們相信，在多學科研究人員和臨床工作者的不斷共同努力下，基于SERS的生物樣本檢測技術將得到進一步改進，并將穩(wěn)步向臨床應用方向發(fā)展。

6 展 望

拉曼光譜作為一種無損、非接觸式且可重復的快速檢測技術，能夠提供分子結構振動的指紋圖譜信息且譜峰窄不易發(fā)生重疊，在生化物質檢測中具有顯著優(yōu)勢。SERS有望實現(xiàn)高靈敏分析檢測核酸的技術，在臨床分子診斷、食品安全、病原微生物檢測領域展現(xiàn)了潛在的應用價值。相信隨著納米技術、生物芯片、微流體技術的進步以及便攜式拉曼光譜儀、生物樣本拉曼光譜數(shù)據(jù)庫的完善，SERS技術會在不久的將來廣泛應用于生物樣本檢測，尤其是核酸分子診斷領域，為臨床實驗室診斷提供一種強大的分析技術。