邢媛媛，陳金亮，陳建榮，呂學(xué)東

南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科1、急診科2，江蘇 南通 226001

慢性阻塞性肺疾病急性加重(acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者住院治療的主要原因[1]。調(diào)查顯示，14%～30%的AECOPD 患者在出院后60 d 內(nèi)需要重新住院治療[2-3]。由于急性加重是COPD 自然病程中的關(guān)鍵事件，減少早期再入院已成為COPD 患者管理的重要臨床目標(biāo)[4]。因此，確定住院和再入院的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后因素可以實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。COPD 的特征是氣道重塑和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞在其中起關(guān)鍵作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在氣道和組織中的浸潤(rùn)程度與COPD 的嚴(yán)重程度相關(guān)，并與穩(wěn)定COPD 患者的支氣管細(xì)菌定植和1秒用力呼氣容積(FEV1)下降相關(guān)[6]。呼出氣冷凝液(exhaled breath condensate，EBC)作為一種非侵入性方法，用于評(píng)估許多肺部疾病(如COPD)的炎癥，在AECOPD患者中運(yùn)用具有良好的耐受性[7]。EBC 來(lái)源于整個(gè)支氣管樹(shù)(近端和遠(yuǎn)端氣道)的氣溶膠顆粒，許多與COPD 患者痰中性粒細(xì)胞趨化活性有關(guān)的化學(xué)引誘劑，如白三烯B4、白介素-8 均可在EBC中檢測(cè)到[8]。然而，目前關(guān)于AECOPD 住院患者EBC中性粒細(xì)胞趨化活性尚未被研究。因此，本研究旨在評(píng)價(jià)EBC 中性粒細(xì)胞趨化活性是否有助于預(yù)測(cè)AECOPD患者的早期不良結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集2016 年1 月1 日至2018 年12 月31 日在南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院治療的108例AECOPD 患者的臨床資料，按照特定的ICD-10 初級(jí)出院代碼進(jìn)行的回顧性隊(duì)列研究。本研究所分析的資料從醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)中獲取。所有數(shù)據(jù)收集均由其中一位作者審閱完成。研究人群包括出院報(bào)告中提到的18歲或18歲以上的無(wú)吸煙史的AECOPD患者。排除在住院期間死亡患者、違反醫(yī)囑出院的患者以及從另一個(gè)急性醫(yī)療機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移到另一個(gè)急性醫(yī)療機(jī)構(gòu)的患者。AECOPD 定義為疾病自然過(guò)程中的一個(gè)事件，其特征是患者的基線呼吸困難、咳嗽和/或痰的變化超出正常的日常變化，急性發(fā)作，可能需要改變常規(guī)藥物治療[2]。該方案得到本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者知情同意本研究。

1.2 資料收集 觀察所有受試者在出院后60 d內(nèi)因AECOPD 和任何原因再入院或死亡的發(fā)生率。從患者的電子病歷中收集以下數(shù)據(jù)：①人口統(tǒng)計(jì)學(xué)：年齡、性別；②入院時(shí)生命體征：心率(HR)、收縮壓和舒張壓、呼吸環(huán)境空氣時(shí)血氧飽和度(SO2)；③共病：查爾森合并癥指數(shù)、高血壓、糖尿病、充血性心力衰竭及實(shí)體或血液惡性腫瘤史；④實(shí)驗(yàn)室檢查值：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、pH、二氧化碳分壓(pCO2)和血漿肌酐；⑤EBC中性粒細(xì)胞趨化性。使用Advia 120血液分析儀(德國(guó)西門(mén)子醫(yī)療診斷公司)測(cè)量血液學(xué)值。肌酐使用全自動(dòng)生化分析儀Dimension(德國(guó)西門(mén)子醫(yī)療診斷公司)測(cè)量，血?dú)夥治鍪褂肎EM 3500血?dú)夥治鰞x(美國(guó)Instrumentation Laboratories 公司)。所有樣本采集和測(cè)量均在病情惡化期間。

1.3 EBC收集方法 EBC通過(guò)EcoScreen商用冷凝器(德國(guó)Erich Jaeger Viasys GmbH 公司)收集。受試者通過(guò)與冷凝器相連的喉管以正常頻率和潮氣量呼吸，持續(xù)10 min。收集1.5～2 mL 的EBC，并在收集后5 min 內(nèi)立即(以250 L 等份)在-80℃下儲(chǔ)存，直到分析。通過(guò)測(cè)定α-淀粉酶濃度(酶比色法，檢測(cè)限為3 U/mL)，對(duì)所有樣本進(jìn)行唾液污染檢測(cè)。

1.4 中性粒細(xì)胞分離 從同一非特應(yīng)性和非吸煙健康志愿者的40 mL 外周靜脈血中分離中性粒細(xì)胞。全血用6%右旋糖苷(瑞典Pharmacia 公司)處理45 min，沉淀紅細(xì)胞。將富含白細(xì)胞的液相用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3 次，并通過(guò)比重為1.077 的淋巴細(xì)胞分離液(天津市TBD生物技術(shù)發(fā)展中心)密度梯度離心(在室溫下400×g 離心30 min)分離單核白細(xì)胞和粒細(xì)胞部分(>95%中性粒細(xì)胞)。中性粒細(xì)胞在PBS 中洗滌兩次，然后置于Hank 的平衡鹽溶液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL。

1.5 EBC中性粒細(xì)胞趨化性測(cè)定 采用Boyden小室對(duì)EBC中性粒細(xì)胞的趨化活性進(jìn)行評(píng)估。將28 μL的EBC等份置于下腔，將50 μL的細(xì)胞懸液(106個(gè)細(xì)胞/mL)置于上腔，兩個(gè)腔室中間隔以0.8 μm孔徑Nuclepore?膜(美國(guó)Whatman公司)。在37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育60 min。拆除小室，并從膜的上表面刮下未遷移的細(xì)胞。然后將膜浸入甲醇中并染色(Diff-Quick染色；美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。高倍鏡下對(duì)膜下表面的遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果表示為每10個(gè)高倍視野遷移的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)。以細(xì)胞遷移率和EBC/細(xì)胞遷移率為指標(biāo)計(jì)算趨化指數(shù)(chemotactic index，CI)。值為1.0表示沒(méi)有趨化活性。本實(shí)驗(yàn)室CI正常范圍是1.0～2.4。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 定量變量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)或中位數(shù)(四分位)表示，定性變量用例數(shù)和百分比表示。采用獨(dú)立樣本學(xué)生t 檢驗(yàn)比較正態(tài)分布均值，或秩和檢驗(yàn)比較非正態(tài)分布值。χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)用于分析計(jì)數(shù)變量之間的差異。采用多元正逐步Logistic 回歸分析患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)因素、共病性、入院時(shí)生命體征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和60 d不良事件之間的關(guān)系。根據(jù)與首次住院60 d 不良事件相關(guān)的雙變量顯著性水平(P＜0.1)，選擇變量作為多變量分析的候選變量。為了評(píng)價(jià)CI 的預(yù)后能力，計(jì)算ROC 曲線下面積(AUC)，通過(guò)AUC下面積的增加來(lái)評(píng)估CI對(duì)其他臨床預(yù)測(cè)因子的附加預(yù)后價(jià)值。隨后進(jìn)行COX 回歸分析，根據(jù)CI 的實(shí)驗(yàn)室上限生成調(diào)整后的生存曲線。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS23.0進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征 108 例患者中，首次住院后60 d 再入院率為25.92%。其中42.86%的再入院由AECOPD引起。5例(4.6%)在出院后60 d內(nèi)死亡(其中3例在死亡前至少再入院一次)。共記錄30例(27.8%)不良事件。整個(gè)隊(duì)列和60 d 不良事件患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征見(jiàn)表1。

2.2 多變量相關(guān)分析60 d不良事件相關(guān)因素 所有患者在出院前進(jìn)行了血?dú)夥治?，并納入了相關(guān)性分析。其中49 例(45.4%)患者的CI 值正常(低于2.4)。表2 顯示了人口統(tǒng)計(jì)學(xué)因素、合并癥、入院時(shí)生命體征，實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果和60 d不良事件之間的相關(guān)性二元和多變量分析。結(jié)果顯示，充血性心力衰竭、出院時(shí)pH 低于7.35 和出院時(shí)CI 異常(>2.4)是與復(fù)合不良結(jié)局相關(guān)的唯一變量。出院時(shí)CI異常(>2.4)和查爾森共病指數(shù)>5與AECOPD所致的再入院有關(guān)。

注：aFisher精確檢驗(yàn)。

表2 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)因素、共病性、入院時(shí)生命體征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果與60 d不良事件的雙變量和多變量相關(guān)分析結(jié)果(n=108)

2.3 AECOPD 患者CI、查爾森共病指數(shù)與60 d AECOPD 導(dǎo)致的再入院率的關(guān)系 在所有查爾森共病指數(shù)四分位數(shù)中，CI異常與AECOPD導(dǎo)致的再入院風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)(圖1)。使用COX回歸模型對(duì)每個(gè)CI亞組生成校正生存曲線，CI異?；颊咭駻ECOPD導(dǎo)致的再入院率(13.56%)顯著高于CI 正?；颊?8.16%)(P=0.034)，見(jiàn)圖2。

圖1 CI、查爾森合并癥指數(shù)與60 d因AECOPD再入院率之間的關(guān)系

圖2 根據(jù)出院時(shí)CI 分組用高查爾森合并癥指數(shù)校正AECOPD 患者60 d再入院的生存曲線

2.4 AECOPD患者CI、充血性心力衰竭、酸中毒與出院后60 d復(fù)合終點(diǎn)的關(guān)系 當(dāng)模型中忽略CI時(shí)，充血性心力衰竭和出院前酸中毒是與兩種不良結(jié)局相關(guān)的唯一變量。與無(wú)CI的模型相比，CI的加入顯著改善了AUC(0.587～0.633，P=0.035)。CI、充血性心力衰竭和出院前酸中毒之間的關(guān)系如圖3 所示，CI 異常與復(fù)合終點(diǎn)發(fā)生率增加相關(guān)。使用COX 回歸模型對(duì)每個(gè)CI亞組生成校正生存曲線，CI異?；颊咭驈?fù)合終點(diǎn)導(dǎo)致的再入院率(37.29%)顯著高于CI 正?；颊?16.33%)(P=0.014)(圖4)。研究評(píng)估出院前CI 對(duì)出院后60 d 復(fù)合終點(diǎn)事件的預(yù)測(cè)價(jià)值：AUC 為0.615(95%CI：0.607～0.650)，最適閾值為2.48，敏感性69.01%，特異性48.62%。

圖4 根據(jù)出院時(shí)CI分組用充血性心力衰竭和出院前酸中毒校正60 d復(fù)合終點(diǎn)發(fā)生的生存曲線

3 討論

AECOPD 嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后[1]。AECOPD 導(dǎo)致的高再入院率是目前臨床重點(diǎn)關(guān)注問(wèn)題，如何減少AECOPD 患者再入院是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3]。盡管許多人口學(xué)因素和合并癥被認(rèn)為是與早期再入院相關(guān)的重要危險(xiǎn)因素，但尚無(wú)公開(kāi)的算法將識(shí)別出的危險(xiǎn)因素整合到可用于再入院預(yù)測(cè)的有效模型中[9]。確定需要再入院的AECOPD患者并在住院期間提前實(shí)施干預(yù)措施，對(duì)降低再入院率至關(guān)重要。

目前，僅有少數(shù)研究中提到了實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)在AECOPD 患者出院后危險(xiǎn)分層中的指導(dǎo)價(jià)值，并證實(shí)pCO2是患者再入院的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。BAHADORI等[11]發(fā)現(xiàn)AECOPD 住院后高平均pCO2與再入院率之間存在顯著相關(guān)性。此外，F(xiàn)UHRMAN等[12]認(rèn)為pCO2是AECOPD患者住院后高死亡率的危險(xiǎn)因素，但由于缺乏與AECOPD患者短期預(yù)后相關(guān)的客觀變量，對(duì)降低再入院率極為困難。這項(xiàng)研究證明了CI 增加是一個(gè)穩(wěn)健的獨(dú)立的負(fù)性預(yù)后因素，與AECOPD住院后的不良結(jié)局相關(guān)，特別是與早期再入院率高相關(guān)。ROC分析表明，出院時(shí)CI的加入顯著改善了充血性心力衰竭和出院前酸中毒預(yù)測(cè)出院后60 d 終點(diǎn)事件發(fā)生的AUC(0.587～063 3，P=0.035)。與以往的研究一致，充血性心力衰竭合并癥和出院時(shí)酸中毒與再入院和死亡率相關(guān)[13]。值得注意的是，查爾森共病指數(shù)的增加與因AECOPD再入院率較低相關(guān)，而與全因?qū)е碌脑偃朐郝瘦^高有關(guān)。這可以解釋為病情較重的患者由于其他醫(yī)療狀況差而使全因住院率升高，這些情況可能因AECOPD、藥物治療(例如皮質(zhì)類固醇)或住院后繼發(fā)的病情加重而惡化。

COPD的病理特征是氣道重塑和由中性粒細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞組成的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞與COPD 的發(fā)病有關(guān)，并且中性粒細(xì)胞在氣道和組織中的浸潤(rùn)程度與COPD 的嚴(yán)重程度有關(guān)[6]。導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞積聚的機(jī)制還不清楚，目前認(rèn)為它們可能與外周血中性粒細(xì)胞內(nèi)流增強(qiáng)有關(guān)[6]。此外，COPD患者支氣管分泌物中的髓過(guò)氧化物酶、彈性蛋白酶、IL-8 和LTB4 被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘劑[8]。EBC的取樣為觀察COPD患者和哮喘患者氣道局部生化模式提供了一種無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便易行的方法，在健康人和COPD 患者的EBC 中也檢測(cè)到中性粒細(xì)胞的一些化學(xué)引誘劑[15]。在穩(wěn)定的COPD患者EBC中發(fā)現(xiàn)白三烯B4 濃度升高，并且在惡化期間進(jìn)一步升高，而在抗生素治療后逐漸減少[16]。此外，COPD患者呼出白細(xì)胞介素(IL)-6的增加被發(fā)現(xiàn)與EBC中性粒細(xì)胞的趨化活性有關(guān)[17]。然而，到目前為止對(duì)EBC的生物活性的研究卻很少。本研究發(fā)現(xiàn)，出院時(shí)CI異?；颊咴陔S訪60 d 因AECOPD 重新入院和復(fù)合終點(diǎn)發(fā)生情況均較CI正?；颊吒?，并且進(jìn)一步多變量相關(guān)分析顯示CI 異常與復(fù)合不良結(jié)局以及AECOPD所致的再入院有關(guān)。表明COPD 急性發(fā)作期EBC 中性粒細(xì)胞趨化活性對(duì)預(yù)后產(chǎn)生影響。這些發(fā)現(xiàn)符合這樣一個(gè)事實(shí)，即中性粒細(xì)胞性氣道炎癥確實(shí)是COPD 的一個(gè)主要特征。此外，由于吸煙已被證實(shí)增加了中性粒細(xì)胞的趨化活性，為了不受煙草的影響，本研究排除了吸煙者[18]。

總之，本研究證明AECOPD 患者出院時(shí)CI 升高與早期再入院和死亡率增加相關(guān)。CI 增加可能是患者中性粒細(xì)胞性氣道炎癥的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，CI參數(shù)可以提供有用的預(yù)測(cè)信息，并有助于高質(zhì)量的出院決策。CI 值增加的患者應(yīng)得到更密切和更深入的管理，以改善其臨床結(jié)果。