朱惠娟，朱才義

1.湖南省婦幼保健院超聲科，湖南 長沙 410008；2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518000

中國癌癥新增病例增長迅速，其中肝癌新發(fā)病例占全世界范圍內(nèi)新發(fā)病例的54%，如何從根本上提高肝癌患者生存率、緩解病痛是目前亟待解決的問題[1]。微波消融以其更好的穿透性和更加適形的消融形狀廣泛運用于肝癌的微創(chuàng)治療中[2]，精準評價消融完全與否對于保證消融安全和提高療效意義非常重大[3]。最近有研究表明，彈性成像在微波消融的監(jiān)測與評估上具有實用的價值與廣闊的前景[4-6]。本實驗對熱損傷灶不同區(qū)域內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)黃遞酶進行定性以及半定量評估，對比研究消融灶不同硬度區(qū)的楊氏模量值與消融灶組織學(xué)、細胞酶學(xué)的變化，希望利用剪切波彈性成像(shear wave elastography，SWE)定量反映組織熱損傷程度，以探討楊氏模量定量評價微波消融組織病理改變的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料 30只新西蘭大白兔，6～10個月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供(動物質(zhì)量合格證號SCXK＜湘>2014-0011)，對動物的處置符合動物倫理學(xué)要求[倫理編號：2015(科研倫審)-024]。氯化硝基藍四唑鹽(NBT，Sigma公司，美國)、氧化型輔酶Ⅰ(NAD，Sigma公司，美國)、吩嗪硫酸甲酯(PMS，Sigma 公司，美國)、4%乳酸鈉20 mL(中衫金橋生物公司)、麻醉劑：1%戊巴比妥鈉溶液(江萊生物科技公司)。

1.2 主要儀器及手術(shù)器械 EC0-100C型組織間實體瘤超聲引導(dǎo)微波凝固治療儀(南京億高公司)、Aixplorer 超聲波診斷儀(SuperSonic Imagine 公司)、SCI5-4 線陣探頭(頻率為4～15 MHZ，法國SuperSonic Imagine)、肝臟手術(shù)器械包(自備)。

1.3 手術(shù)方法 1%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)麻醉。在無菌操作下于劍突下腹部正中作“人”字形切口，充分暴露肝臟，將18G 消融針穿過肋間隙，在超聲引導(dǎo)下穿過左外葉進入左內(nèi)葉最厚處。由于兔肝較薄，消融容易損傷周圍組織，通過反復(fù)預(yù)實驗，統(tǒng)一設(shè)置微波治療儀的參數(shù)為：輸出功率40 W，消融時間1 min。準備就緒后，按預(yù)定的消融參數(shù)，進行消融。

1.4 SWE 檢查流程 消融結(jié)束即刻行二維超聲檢查，找到消融灶的最大切面，穩(wěn)定超聲探頭同時運行SWETM 程序。SWE 檢查采用雙幅模式，SWETM取樣框包括全部病灶范圍及周圍肝實質(zhì)，當(dāng)5～6 幀彈性成像穩(wěn)定后，SWE根據(jù)組織硬度的不同轉(zhuǎn)換成彩色圖譜。當(dāng)顏色呈現(xiàn)勻和穩(wěn)定的狀態(tài)，且整個顏色區(qū)域至少包含2/3 取樣框時，切面前方無手法過重引起顏色誤判，后方無噪聲干擾時，彈性圖變化基本一致時，認為檢查成功。運行SWE 測量程序(Q-BOXTM)，統(tǒng)一彈性值圈設(shè)置直徑為1 mm，將彈性值圈放在感興趣區(qū)(region of interest，ROI)，包括消融區(qū)、消融周圍區(qū)、未消融區(qū)，記錄三個區(qū)域的平均楊氏模量值(SWE mean)，以kPa 表示，每個區(qū)域任意選取5個位置測量，取平均值。所有測量均為同一個醫(yī)生操作完成，每次測量必須保證超聲切面的一致性。

1.5 標本取材及處理方法 注射過量麻醉劑處死實驗兔，取消融灶組織并保留周圍正常組織5 mm作為檢測標本，迅速切除消融灶組織，將標本保證在同一個超聲切面下切開，將完整的標本放在液氮中速凍，行OCT 包埋后做冰凍切片，行NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色法，每個標本抽取平整無折疊4張冰凍切片。

1.6 NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色法 孵育液由硝基藍四唑鹽(NBT) 100 mg、氧化型輔酶I (NAD+)50 mg、磷酸鹽緩沖液80 mL、吩嗪硫酸甲酯(PMS)10 mg、4%乳酸鈉溶液20 mL 組成。統(tǒng)一將切片整齊放入孵育盒中，浸泡30 min，用雙蒸水沖洗切片10 min，晾干后用甘油明膠封片劑進行封片。陰性對照實驗：將以上孵育液不加入乳酸鈉，其他成分不變，按上述方法進行染色作為對照。

1.7 NADH 黃遞酶染色原理 細胞質(zhì)內(nèi)含有大量乳酸脫氫酶，代表了細胞的活力，它可以將底物乳酸鈉催化形成丙酮酸，同時將H+傳遞給NAD+，生成的NADH可以與硝基藍四唑鹽反應(yīng)生成藍紫色顆粒，沉淀于胞漿內(nèi)。消融灶內(nèi)細胞由于微波熱損傷而失活，線粒體內(nèi)的酶被破壞，故胞漿不染色。

1.8 酶組織化學(xué)染色定量分析 將NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色的冰凍切片放在400 倍視野下觀察，每張切片隨意選取10 個視野，利用圖像分析軟件Image-Plus 6.0 定量測量切片中NADH 黃遞酶在消融區(qū)、消融周圍區(qū)、正常未消融區(qū)表達的顆粒數(shù)量、累積光密度值(integrated optical density，IOD)，取平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料符合非正態(tài)分布規(guī)律，以中位數(shù)M (P25，P75)表示，組間差異性比較采用Kruskal-Wallis檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消融后消融灶彈性變化圖及肉眼觀圖分布情況 彈性成圖根據(jù)消融后組織硬度的差異進行彩色編碼，形成以電極為中心3個類圓形區(qū)域，即消融區(qū)(紅色區(qū)圖1A)：SWE 顯示紅色區(qū)域，楊氏模量值為高值；消融周圍區(qū)(黃色區(qū)圖1B)：SWE顯示黃綠色區(qū)域，楊氏模量值介于高值與正常值之間；未消融區(qū)(藍色區(qū)圖1C)：藍色區(qū)域，楊氏模量值為低值。肉眼觀下，消融即刻兔肝組織可分為消融區(qū)、消融周圍區(qū)和未消融區(qū)，見圖2。

圖1 兔肝組織即刻消融后的彈性成圖

圖2 兔肝組織消融后不同區(qū)域肉眼觀

2.2 彈性圖與消融即刻兔肝組織病理學(xué)變化 彈性成圖根據(jù)消融后組織硬度的差異進行彩色編碼，形成以電極為中心3個類圓形區(qū)域(圖3)。消融區(qū)：在彈性圖變化上為紅色區(qū)域A，楊氏模量值為94.95 kPa，NADH 黃遞酶染色上未見藍染顆?；驑O少數(shù)藍染顆粒，記為-或±；消融周圍區(qū)B：彈性圖變化上為黃綠色區(qū)域，楊氏模量值為37.85 kPa，NADH黃遞酶染色顯示散在、稀疏的藍染顆粒，記為++；未消融區(qū)C：彈性圖變化上為藍色區(qū)域，楊氏模量值為10.30 kPa，NADH黃遞酶染色顯示細胞質(zhì)內(nèi)可見密集、大片藍染顆粒，證明該區(qū)域內(nèi)酶有活性，細胞功能正常，記為+++。

2.3 消融區(qū)、消融周圍區(qū)和未消融區(qū)內(nèi)NADH黃遞酶表達的顆粒數(shù)量、IOD 及楊氏模量值比較 經(jīng)Kruskal-Wallis 檢驗，結(jié)果顯示：顆粒數(shù)量、IOD、楊氏模量值在消融區(qū)、消融周圍區(qū)、正常未消融區(qū)三者之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明，消融后的肝臟組織，其酶的顆粒數(shù)量、IOD、楊氏模量值在各區(qū)域存在差異性，相對于正常組織，在消融區(qū)低表達，在消融周圍區(qū)介于兩者之間；微波消融后組織明顯變硬，越靠近消融區(qū)組織硬度增大，楊氏模量值增高，越靠近正常未消融區(qū)硬度變軟，對應(yīng)的楊氏模量值降低，見表1。

2.4 楊氏模量值與NADH 黃遞酶表達的顆粒數(shù)量、IOD的相關(guān)性 楊氏模量值與NADH黃遞酶表達的顆粒數(shù)量呈負相關(guān)(r=0.703，P＜0.001)；楊氏模量值與NADH 黃遞酶表達的IOD 呈負相關(guān)(r=0.657，P＜0.001)，見圖4和圖5。

圖3 NADH黃遞酶組織化學(xué)染色(NADH×400)

表1 消融灶三個區(qū)域內(nèi)NADH黃遞酶表達的顆粒數(shù)量、IOD以及楊氏模量值比較[M(P25，P75)]

圖4 楊氏模量值與顆粒數(shù)量的散點圖(r=-0.703，P＜0.001)

圖5 楊氏模量值與IOD的散點圖(r=-0.657，P＜0.001)

3 討論

微波消融成為治療肝臟惡性腫瘤的重要手段之一，這種高效率的手術(shù)方法已獲得了與外科手術(shù)旗鼓相當(dāng)?shù)倪h期療效，更新了微創(chuàng)手術(shù)記錄[7]。精準評價消融效果對于保證消融安全和提高療效意義重大，最近研究表明，彈性成像在微波消融的監(jiān)測與評估上具有實用的價值與廣闊的前景。WIGGERMANN等[8]認為超聲彈性技術(shù)可以初步反映肝臟凝固灶的范圍；彭金波等[9]分析了彈性成像技術(shù)對射頻消融灶邊界顯示清晰，有望成為評價射頻消融灶的有效方法；本實驗的前期研究也表明，彈性成像在評價消融灶范圍的可行性。

本研究中運用超高速剪切波彈性成像定量評估組織硬度的技術(shù)特點，探討它對即刻消融灶熱損傷進行定量評估的可行性。肝組織經(jīng)過有效熱場的作用發(fā)生蛋白質(zhì)變性，無疑使硬度明顯增加，彈性成圖根據(jù)消融后組織硬度的差異進行彩色編碼，以電極為中心形成3 個類圓形區(qū)域：消融區(qū)(A)，SWE 顯示紅色區(qū)域；消融周圍區(qū)(B)，SWE 顯示黃綠色區(qū)域，正常未消融區(qū)(C)，SWE顯示藍色區(qū)域，同時觀察與測量三個區(qū)域內(nèi)的楊氏模量值分布情況，結(jié)果顯示各組差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，并且楊氏模量值以電極為中心形成規(guī)律性地遞減，因此說明SWE 可以初步反映消融即刻組織硬度的分布情況，這與國內(nèi)、外研究一致。SUGIMOTO 等[5]對大鼠的肝臟進行微波消融，并用3D的SWE來進行評估，發(fā)現(xiàn)消融灶中心、消融邊界、未消融區(qū)的楊氏模量值分別為(59.1±21.9) kPa、(43.1±1.5)kPa、(10.3±0.8)kPa，說明楊氏模量值與熱損傷的程度存在一定的相關(guān)性；其次在消融邊界的研究上，MARIANI等[10]通過對長白山豬肝的射頻消融灶進行彈性評估，將消融邊界的細胞進行HE染色，預(yù)測豬肝組織凝固性壞死與否的彈性閾值為20 kPa。這說明SWE 的優(yōu)勢不僅可以提高常規(guī)超聲對消融范圍的辨別能力，還能夠?qū)M織的熱損傷程度提供一定的參考依據(jù)，因此，定量評估組織硬度對來判斷消融療效具有一定的前景，也給未來彈性成像在微波消融的監(jiān)測過程提供了新的研究方向。

本研究試圖從細胞學(xué)角度，探討楊氏模量值與定量評估消融熱損傷的可行性。本實驗選取NADH黃遞酶組織化學(xué)染色來衡量細胞在即刻消融后功能上的變化，研究發(fā)現(xiàn)消融區(qū)在彈性圖變化上為紅色區(qū)域，楊氏模量值顯示最高的區(qū)域，NADH黃遞酶染色上未見藍染顆?；驑O少數(shù)藍染顆粒，記為-或±；消融周圍區(qū)在彈性圖變化上為黃綠色區(qū)域，楊氏模量值介于高值與正常值之間，NADH黃遞酶染色顯示散在、稀疏的藍染顆粒，記為++；未消融區(qū)在彈性圖變化上為藍色區(qū)域，楊氏模量值為低值的區(qū)域，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇稍擴張，細胞質(zhì)內(nèi)可見密集、大片藍染顆粒，記為+++。

與HE 染色相比，NADH 黃遞酶組織化學(xué)染色在評價即刻消融效果上更敏感。由于消融即刻可能對細胞具有一定的熱固定作用，短時間內(nèi)細胞不會發(fā)生改變，因此，從細胞形態(tài)學(xué)角度出發(fā)，HE 染色難以判斷消融即刻細胞壞死的程度，利用酶組織化學(xué)染色可以檢測消融邊界的細胞活性[11-13]。本實驗中發(fā)現(xiàn)消融周圍區(qū)細胞呈散在陽性，相對于正常區(qū)域內(nèi)的酶活性強度明顯減弱，細胞損傷程度較消融中心輕微，并且對NADH黃遞酶表達的顆粒數(shù)量、IOD在三個區(qū)域內(nèi)分布情況進行定量分析，發(fā)現(xiàn)各組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，定量分析可以更加直觀、具體地反映消融即刻組織的損傷程度與細胞活性改變。

通過Image-Plus 6.0圖像分析軟件對消融區(qū)、消融周圍區(qū)、正常未消融區(qū)內(nèi)NADH黃遞酶表達的的顆粒數(shù)量、累積光密度值作定量分析，最后利用楊氏模量值與NADH黃遞酶表達的顆粒數(shù)量、IOD之間作相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)楊氏模量值與藍染的顆粒數(shù)量存在負相關(guān)，楊氏模量值與IOD存在負相關(guān)。消融區(qū)組織損傷程度高，導(dǎo)致線粒體內(nèi)酶的活性越低，楊氏模量值反而越高，越靠近正常區(qū)域壞死程度越小，細胞內(nèi)酶活性越高，楊氏模量值越小。超高速剪切波彈性成像可通過測量楊氏模量值初步定量評估微波消融的熱損傷程度。

超高速剪切波彈性成像用于微波消融的監(jiān)測還屬于初步研究階段，本實驗是超高速剪切波彈性成像在定量評估即刻消融組織熱損傷程度上的初探，利用楊氏模量的物理特性，探討消融即刻楊氏模量值與消融即刻細胞活性改變之間的相關(guān)性。SWE 的優(yōu)勢是能夠?qū)M織熱損傷程度提供一定的參考數(shù)據(jù)，其可通過測量楊氏模量值初步定量評估微波消融的熱損傷，給未來彈性成像在微波消融的監(jiān)測過程提供新的研究方向。