劉瑞杰,李文峰,蘭 軍*

(1東莞市松山湖中心醫(yī)院心內(nèi)科,東莞 523326;2南昌大學(xué)附屬贛州醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:DRliuruijie@163.com)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在體外培養(yǎng)、增殖后移植在心肌梗死部位,可存活并分化為心肌細(xì)胞,改善心臟功能,是治療和修復(fù)心肌損傷時(shí)最為成熟的細(xì)胞[1]。不同的臨床研究(或臨床試驗(yàn)),采用不同的治療方案,雖然短期內(nèi)均能逆轉(zhuǎn)缺陷后引發(fā)的心肌重構(gòu)、改善缺血區(qū)的心肌功能、提高左心室射血分?jǐn)?shù)、減少左心室收縮末期容積,但是很多指標(biāo)改善不明顯,長(zhǎng)期療效并不優(yōu)于對(duì)照組[2]。目前干細(xì)胞移植療效不理想的重要原因之一是心肌局部微環(huán)境缺氧導(dǎo)致移植細(xì)胞歸巢、定植能力低下。如能通過(guò)促進(jìn)心肌微血管生成從而改善局部微環(huán)境缺氧,將有望提高干細(xì)胞移植的療效。IGF-1是調(diào)控心肌細(xì)胞存活的重要營(yíng)養(yǎng)因子,參與心臟發(fā)育等生理過(guò)程[3,4]。缺血缺氧引起心肌細(xì)胞凋亡是引起心臟功能下降的關(guān)鍵因素。雖然IGF-1對(duì)BMSCs細(xì)胞凋亡的作用已有報(bào)道,但過(guò)表達(dá)IGF-1的BMSCs分泌物對(duì)缺氧模型下的心肌細(xì)胞凋亡作用尚不清楚。本研究擬通過(guò)慢病毒技術(shù)將IGF-1基因感染BMSCs細(xì)胞,探討過(guò)表達(dá)IGF-1對(duì)BMSCs及其過(guò)表達(dá)IGF-1-BMSCs上清培養(yǎng)液的心肌細(xì)胞的抗凋亡能力有無(wú)改善作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)4周齡雄性C57BL/6小鼠40只,購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué),動(dòng)物合格證號(hào)[SCXK(粵)2019-0265]。動(dòng)物喂養(yǎng)及觀察均按照非臨床研究管理規(guī)范進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑及器材 BMSCs低糖的培養(yǎng)基(Cyagen Bioscience,賽業(yè)生物科技有限公司);10% FBS(Gibco Bioscience);細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(PI及Annexin Ⅴ Alexa Fluor 488,Invitrogen公司);caspase-3,8,9和Bax,Bcl-2以及cytochrome C抗體(Cell Signal Technology,CST公司);CD29,CD44,CD11b及SCA-1抗體購(gòu)自BioLegend公司。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 將小鼠脫臼處死后用碘伏侵泡5 min,無(wú)菌條件下分離出小鼠股骨和脛骨,離體的骨骼放入滅菌PBS緩沖液中沖洗。剪去干骺端,暴露骨髓腔,無(wú)菌注射器抽取未添加肝素的含10% FBS,100 mg/L鏈霉素的BMSCs低糖培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔,直至腔內(nèi)所有骨髓血沖凈。接種于含10%胎牛血清的BMSCs低糖的培養(yǎng)基,置于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)5% CO2,飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d首次換液,以后每3 d換液1次,以0.25%胰蛋白酶消化后在第3代用磁珠進(jìn)行分選,去除造血干細(xì)胞祖細(xì)胞。然后傳代培養(yǎng)至第7代。取P7代的BMSCs細(xì)胞,融合超過(guò)80%之后,取生長(zhǎng)良好的BMSCs細(xì)胞,以0.25%胰酶消化細(xì)胞,按1×109/L重懸細(xì)胞,PBS洗滌1次,重懸細(xì)胞并分4管,分別加入100 μl CD29,CD44,CD11b及SCA-1(采用統(tǒng)一的1 ∶20倍數(shù)稀釋至100 μl),避光孵育30 min。1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞,倒去上清液,加入500 μl PBS進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)處理 小鼠心臟取下后放入5 ml HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿中,剪掉心房和右心室組織后用眼科鑷撕扯成小碎塊。然后用滴管反復(fù)吹打直至大碎塊消失,通過(guò)60目篩網(wǎng)過(guò)濾至50 ml的離心管,然后用膠原酶消化,20 r/min離心2 min后轉(zhuǎn)移至含有1 000 mmol/L鈣的HBSS緩沖液,對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)鈣自然沉淀后,棄上清,向細(xì)胞沉淀中加入含HEPES(25 mmol/L)、肌酸(5 mmol/L)、2% FBS、L-肉毒堿(2 mmol/L)、?；撬?5 mmol/L)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%雙抗無(wú)血清的M199培養(yǎng)基中,放入5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞分組及實(shí)驗(yàn)處理 缺氧模型構(gòu)造時(shí),將細(xì)胞置于缺氧工作站的低氧艙室(1% O2,5% CO2,94% N2)中培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。按是否進(jìn)行缺氧處理,分為正常組(control)及缺氧組(hypoxia)。按是否攜帶IGF-1基因的細(xì)胞分為:IGF-1-BMSCs及對(duì)照NC-BMSCs。觀察心肌細(xì)胞時(shí),按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)組別的BMSCs培養(yǎng)上清液,時(shí)間梯度為12,24,48,60 h;濃度梯度(BMSCs上清液與原培養(yǎng)基體積比)為0%,25%,50%,75%。為了研究過(guò)表達(dá)IGF-1對(duì)小鼠BMSCs細(xì)胞低氧狀態(tài)下凋亡情況的影響,BMSCs進(jìn)行了低氧誘導(dǎo),然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率。為了確定上調(diào)IGF-1基因的小鼠BMSCs細(xì)胞的細(xì)胞分泌物對(duì)心肌細(xì)胞是否發(fā)揮作用,BMSCs培養(yǎng)后的上清液被收集,并加入到心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中,觀察BMSCs上清液對(duì)低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡情況的影響。

1.2.4 慢病毒載體及IGF-1過(guò)表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 從cDNA庫(kù)調(diào)取IGF-1基因后克隆插入慢病毒包裝質(zhì)粒GV308中,形成IGF-1包裝的慢病毒質(zhì)粒。而后將該質(zhì)粒感染小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs,并加入強(qiáng)力霉素(doxycycline,DOX)開(kāi)啟基因表達(dá)。感染成功后通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)IGF-1基因的表達(dá)情況。為了研究過(guò)表達(dá)IGF-1對(duì)小鼠BMSCs細(xì)胞低氧狀態(tài)下的凋亡情況影響,首先構(gòu)建了過(guò)表達(dá)IGF-1的小鼠BMSCs細(xì)胞。用慢病毒感染原代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)48 h后,進(jìn)行熒光觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá) 按照Cell Apoptosis Kit with Annexin Ⅴ Alexa Fluor 488 & PI for Flow cytometry說(shuō)明書(shū)完成流式細(xì)胞檢測(cè)。為了進(jìn)一步了解過(guò)表達(dá)IGF-1基因?qū)π∈驜MSCs細(xì)胞低氧誘導(dǎo)的蛋白分子機(jī)制,低氧誘導(dǎo)之后的BMSCs細(xì)胞裂解后進(jìn)行了Western blot檢測(cè),大致流程為:在處理后不同時(shí)間點(diǎn)收集各組細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞后,加入300 μl的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,分別用Annexin Ⅴ-FITC和PI標(biāo)記細(xì)胞,而后上機(jī)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。

免疫印跡檢測(cè)caspase-3,caspase-8,caspase-9和Bax,Bcl-2以及cytochrome C的表達(dá):細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理48 h,而后通過(guò)相應(yīng)抗體進(jìn)行蛋白檢測(cè),最后通過(guò)顯影成像,用Quantity one進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA),事后組內(nèi)兩兩比較采用Bonferroni post檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMSCs中CD29、CD44及SCA-1的表達(dá)

為了確保培養(yǎng)的小鼠BMSCs細(xì)胞具有專(zhuān)一性,利用流式細(xì)胞檢測(cè)儀對(duì)小鼠BMSCs進(jìn)行表面抗原的檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn),80%的小鼠BMSCs高表達(dá)CD29(表達(dá)率為89%±8%),CD44表達(dá)率為95%±6%,SCA-1表達(dá)率為93%±3%,僅0.1%±0.02%的細(xì)胞表達(dá)CD11b。表明所培養(yǎng)的小鼠BMSCs大部分都為間充質(zhì)干細(xì)胞,為隨后的實(shí)驗(yàn)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.2 慢病毒感染BMSCs后IGF-1基因的表達(dá)情況

結(jié)果表明,慢病毒感染BMSCs后IGF-1病毒感染率在96%±3%以上(見(jiàn)圖1)。IGF-1-BMSCs組中IGF-1表達(dá)量與對(duì)照組(NC-BMSCs)相比,明顯增加(P<0.05,見(jiàn)圖1)。表明構(gòu)建過(guò)表達(dá)IGF-1的BMSCs細(xì)胞成功。

與NC-BMSCs組比較,*P<0.05B.Western blot檢測(cè)IGF-1過(guò)表達(dá)病毒感染后IGF-1蛋白的表達(dá)情況圖1 IGF-1過(guò)表達(dá)慢病毒感染的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Figure 1 Primary bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) infected with lentivirus overexpressing IGF-1

2.3 低氧誘導(dǎo)對(duì)BMSCs的凋亡率的影響

結(jié)果表明,低氧誘導(dǎo)時(shí)普通BMSCs及NC-BMSCs細(xì)胞凋亡率顯著增加,而過(guò)表達(dá)IGF-1-BMSCs在低氧時(shí)凋亡率明顯比其他組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。結(jié)果提示,過(guò)表達(dá)IGF-1基因的小鼠BMSCs細(xì)胞在低氧時(shí)可以降低BMSCs細(xì)胞的凋亡率。

表1 低氧誘導(dǎo)48 h后細(xì)胞凋亡率比較

2.4 低氧誘導(dǎo)時(shí)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

低氧誘導(dǎo)時(shí),小鼠BMSCs細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著下降,而促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞色素C(Cyto C)、caspase-3及caspase-8的表達(dá)水平則明顯上調(diào);過(guò)表達(dá)IGF-1則可以顯著提升Bcl-2水平,而抑制Bax、細(xì)胞色素C(Cyto C)、caspase-3及caspase-8的表達(dá)水平(P<0.05,見(jiàn)圖2)。表明過(guò)表達(dá)IGF-1可使小鼠BMSCs細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平上升,同時(shí)抑制促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞色素C(Cyto C)、caspase-3及caspase-8的表達(dá)水平,以達(dá)到低氧誘導(dǎo)下抗凋亡的作用。

與control+BMSCs組比較,*P<0.05;與hypoxia+NC-BMSCs比較,#P<0.05圖2 Western blot檢測(cè)低氧誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)48 h凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of apoptosis-related proteins in BMSCs after hypoxia treatment for 48 h by Western blot

2.5 BMSCs培養(yǎng)基上清對(duì)低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率的影響

與正常培養(yǎng)相比,低氧處理的心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加。而加入50%體積比濃度的IGF-1-BMSCs培養(yǎng)基之后,與NC-BMSCs細(xì)胞上清液相比,其細(xì)胞凋亡率顯著下調(diào)(P<0.05,見(jiàn)表2)。進(jìn)一步,我們觀察了時(shí)間梯度和濃度梯度效應(yīng),結(jié)果顯示IGF-1-BMSCs培養(yǎng)液對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的呈時(shí)間梯度(見(jiàn)表3)和濃度梯度效應(yīng)(見(jiàn)表4)。提示過(guò)表達(dá)IGF-1基因的小鼠BMSCs細(xì)胞上清液可顯著降低缺氧誘導(dǎo)時(shí)心肌細(xì)胞凋亡。

表2 IGF-1-BMSCs培養(yǎng)液對(duì)缺氧誘導(dǎo)時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的影響

表3 IGF-1-BMSCs培養(yǎng)液對(duì)缺氧誘導(dǎo)時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的時(shí)間梯度影響 (%)

表4 不同濃度IGF-1-BMSCs培養(yǎng)液對(duì)缺氧誘導(dǎo)48 h時(shí)心肌細(xì)胞凋亡率的影響 (%)

2.6 BMSCs培養(yǎng)基上清對(duì)低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步確定IGF-1-BMSCs分泌物是否對(duì)心肌細(xì)胞凋亡通路產(chǎn)生影響。加入或者不加入BMSCs上清液后的低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞裂解后進(jìn)行了Western blot檢測(cè),結(jié)果表明:低氧處理的心肌細(xì)胞,與正常培養(yǎng)相比,Bcl-2的表達(dá)水平顯著下降,而B(niǎo)ax、Cyto C、caspase-3及caspase-8的表達(dá)水平則明顯上調(diào),加入IGF-1-BMSCs培養(yǎng)基之后,與NC-BMSCs相比,Bcl-2水平顯著上升,而B(niǎo)ax、細(xì)胞色素C(Cyto C)、caspase-3及caspase-8的表達(dá)水平則下調(diào)(P<0.05,見(jiàn)圖3)。結(jié)果提示IGF-1-BMSCs分泌物通過(guò)調(diào)控凋亡通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞抵抗低氧條件下的凋亡。

與control組比較,*P<0.05;與hypoxia+NC-BMSCs比較,#P<0.05圖3 Western blot檢測(cè)IGF-1-BMSCs培養(yǎng)液對(duì)低氧誘導(dǎo)時(shí)心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Protein expression in cardiomyocytes under the treatment of hypoxia for 48 h with or without culture media from IGF-BMSCs

3 討論

心肌梗死是世界范圍內(nèi)死亡和殘疾的主要原因。急性心肌梗死常引起不可逆轉(zhuǎn)的心肌細(xì)胞壞死,隨著心肌梗死區(qū)域的纖維化和瘢痕形成,發(fā)生左室重構(gòu)并最終導(dǎo)致心力衰竭及惡性心律失常[5]。如何修復(fù)壞死心肌成為一個(gè)新的治療難點(diǎn)。干細(xì)胞具有誘導(dǎo)新生血管生成和組織替代的能力成為治療急性心肌梗死新的治療選擇[6]。越來(lái)越多的研究表明,干細(xì)胞移植可以改善缺血心肌的灌注,提高收縮能力和心肌存活[7]。但是,其具體的機(jī)制目前并不完全清楚,本文為進(jìn)一步探討IGF-1基因?qū)MSCs在低氧情況下抗凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究。

IGF-1在心血管疾病發(fā)生發(fā)展及治療的過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用,它對(duì)心臟及血管起著不可替代的的保護(hù)作用。IGF-1可促進(jìn)心肌細(xì)胞和心肌纖維細(xì)胞的增生,可提高心肌細(xì)胞的收縮力,可提高心臟心輸出量和每搏量,可抑制心肌細(xì)胞凋亡[3]。IGF-1也在心肌重構(gòu)中起重要作用,研究表明IGF-1介導(dǎo)了充血性心力衰竭的心肌重構(gòu),而且原發(fā)性高血壓患者心室肥厚程度及左心室質(zhì)量指數(shù)與血清IGF-1存在明顯的相關(guān)性[4]。IGF-1也參與了福辛普利對(duì)高血壓鼠的心肌保護(hù)作用[8]。為闡明IGF-1保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制,有文獻(xiàn)通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)IGF-1作用于心肌細(xì)胞之后的基因表達(dá)情況進(jìn)行觀察,并證明了Sp1轉(zhuǎn)錄因子是IGF-1作用于心肌細(xì)胞促進(jìn)存活基因轉(zhuǎn)錄上升的關(guān)鍵因子[9]。因此,IGF-1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有很好的保護(hù)作用[10,11]。

BMSCs在合適的微環(huán)境中具有轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞樣細(xì)胞的潛能,而這個(gè)過(guò)程中IGF-1也起著至關(guān)重要的作用[12]。細(xì)胞外分泌的IGF-1通過(guò)IGF-1受體激活體內(nèi)的相關(guān)通路,可介導(dǎo)BMSCs細(xì)胞的細(xì)胞遷移,存活和分化[13]。而通過(guò)阻滯藥抑制IGF-1/IGF-1受體通路,可抑制BMSCs向心肌細(xì)胞分化的進(jìn)程[14]。因此IGF-1對(duì)于BMSCs和心肌細(xì)胞都至關(guān)重要,我們的研究表明,通過(guò)慢病毒的手段在BMSCs中過(guò)表達(dá)IGF-1可顯著提高細(xì)胞的抗凋亡能力,BMSCs培養(yǎng)基中富含細(xì)胞分泌的IGF-1因子,該上清液與心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)后亦可顯著提高心肌細(xì)胞的存活。BMSCs移植被認(rèn)為是目前治療心肌缺氧缺血損傷的研究熱點(diǎn),然后在缺氧缺血灶BMSCs的存活及其定向誘導(dǎo)分化是移植成功的關(guān)鍵。研究表明AKT在BMSCs中過(guò)表達(dá)之后也可對(duì)缺氧時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。而SFRP2則是介導(dǎo)BMSCs-AKT細(xì)胞存活的關(guān)鍵通路。IGF-1是AKT的上游,且IGF-1是BMSCs的一個(gè)重要旁分泌因子[16]。IGF-1可通過(guò)激活A(yù)KT促進(jìn)BMSCs的遷移和分化[17]。進(jìn)一步,IGF-1可通過(guò)線粒體途徑調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡[18],這一點(diǎn)也在本研究中證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒技術(shù)將IGF-1過(guò)表達(dá)與BMSCs,不僅提高了BMSCs在缺氧條件下的抗凋亡能力,且含有IGF-1外分泌組分的培養(yǎng)基對(duì)缺氧條件下的心肌細(xì)胞凋亡也有保護(hù)作用,IGF-1通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2,下調(diào)促凋亡蛋白Bax及Cyto C、caspase-3和caspase-8的水平發(fā)揮作用。

綜上所述,過(guò)表達(dá)IGF-1的BMSCs能夠通過(guò)增強(qiáng)其自身的抗凋亡能力,也能夠通過(guò)其分泌物增強(qiáng)心肌細(xì)胞的抗凋亡能力,改善小鼠心肌細(xì)胞功能。