黃 曄，劉 麗，梁 晶，楊紅霞，李曉麗，徐 寧*

1. 浙江省皮膚病防治研究所藥劑科，浙江 德清 313200 2. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014 3. 湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 湖州 313000 4. 浙江大學(xué)食品及生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310058

引 言

中藥配方顆粒因便于服用、保存和攜帶等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛流通于全國醫(yī)院。目前已獲得各類中藥配方顆粒試點(diǎn)資質(zhì)的企業(yè)高達(dá)57家，然而顆粒劑的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制還沒有建立統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)。同一品種因生產(chǎn)企業(yè)不同仍存在較大差異。蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)或北蒼術(shù)的干燥根莖，具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效[1]。蒼術(shù)顆粒劑無法像飲片一樣通過性狀、顯微鑒別區(qū)分品種和產(chǎn)地信息，亦無法通過高效液相色譜法對(duì)蒼術(shù)素有效定量。主要采用薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、水分測(cè)定法、浸出物測(cè)定法等，對(duì)其有效成分與含量進(jìn)行初步的質(zhì)量檢測(cè)，因此開拓新的有效的質(zhì)量控制方法具有重要意義。

高光譜成像技術(shù)具有高效準(zhǔn)確，無損、無污染的優(yōu)點(diǎn)[2-3]。國內(nèi)外學(xué)者已嘗試通過高光譜成像技術(shù)應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量控制，包括中藥年份鑒別、品種鑒別等。有報(bào)道研究了高光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同年份及放置方式的陳皮建立鑒別模型，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)98.33%，為陳皮年份無損鑒別提供了新的技術(shù)參考。Tankeu等[4]利用高光譜成像技術(shù)結(jié)合偏最小二乘判別分析，區(qū)分出粉防己和廣防己這兩種外觀形態(tài)相似、實(shí)則來源不同科屬、化學(xué)成分截然不同的兩種植物，可以有效防止廣防己混入粉防己。大多數(shù)的研究集中于簡單區(qū)分與防偽，探索高光譜成像技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化快速無損分析的過程中，如何優(yōu)選樣品光譜特征波段，建立準(zhǔn)確度高、預(yù)測(cè)效果好的模型仍是亟需解決的問題。僅李超等[5](Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)對(duì)國內(nèi)8省份18產(chǎn)區(qū)的蒼術(shù)樣品建立了紅外指紋圖譜，而高光譜成像的蒼術(shù)配方顆粒研究尚無報(bào)道。

本工作研究了在高光譜874～1 734 nm區(qū)域3個(gè)不同生產(chǎn)廠家的蒼術(shù)配方顆粒圖譜信息，結(jié)合9種波段數(shù)據(jù)分別建立4種判別模型來尋找潛在的信息，對(duì)不同廠家的蒼術(shù)顆粒劑進(jìn)行快速區(qū)分，并將結(jié)果可視化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

浙江惠松制藥有限公司(廠家A，浙江杭州)、江陰天江藥業(yè)有限公司(廠家B，江蘇江陰)、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司(廠家C，廣東深圳)的蒼術(shù)配方顆粒各50份，共150份樣本。

高光譜成像系統(tǒng)主要包括分辨率為672×512的CCD相機(jī)(C8484-05, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan)，分辨率為2.8 nm的光譜儀(ImSpector N17E; Spectral Imaging Ltd, Oulu, Finland)，線光源(Fiber-Lite DC950, Dolan Jenner Industries Inc, Boxborough, MA)，計(jì)算機(jī)，暗箱和電控移動(dòng)平臺(tái)。高光譜圖像采集前，首先獲取暗電流和參考板的高光譜圖像數(shù)據(jù)，用于數(shù)據(jù)處理前對(duì)原始高光譜圖像的校正。電控移動(dòng)平臺(tái)移動(dòng)速度為17 mm·s-1，工作距離為20.5 cm，曝光時(shí)間2.4 ms，采集在874～1 734 nm范圍樣本的高光譜信息。

1.2 薄層色譜

薄層色譜法步驟參照《中國藥典》2015年版四部 通則0502。

1.3 光譜數(shù)據(jù)及圖像處理

蒼術(shù)顆粒劑樣本分別置于96孔板中，保證每個(gè)樣本在同一高度。黑白校正后設(shè)置樣本區(qū)域作為感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，計(jì)算出每個(gè)樣本ROI范圍內(nèi)874～1 734 nm的平均光譜。采用偏最小二乘判別分析(partial least square discrimination analysis，PLS-DA)、最小二乘支持向量機(jī)(least-squares support vector machine，LS-SVM)、反向人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back propagation neural network，BPNN)、鄰近算法(k-nearest neighbor，KNN)、競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣法(competitive adaptive reweighted sampling，CARS)、隨機(jī)蛙跳算法(random frog，RF)[6]、連續(xù)投影算法(successive projections algorithm，SPA)、序列前向選擇算法(sequential forward selection，SFS)[7]以及相關(guān)性分析(correlation analysis，CA)采用Matlab R2018a(The Math Works, Natick, USA)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒼術(shù)顆粒劑的薄層色譜鑒定及平均高光譜

對(duì)應(yīng)蒼術(shù)對(duì)照藥材薄層色譜的相同位置，各樣品的熒光斑點(diǎn)顏色一致，見圖1(a)。雖然三個(gè)樣品的薄層色譜有些許差別，但不能確認(rèn)樣品的生產(chǎn)商。

蒼術(shù)顆粒劑高光譜敏感波段大都集中在1 100～1 650 nm附近，見圖1(b)。1 100～1 300 nm歸屬于C—H伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻[8]，1 300～1 400 nm歸屬于C—H伸縮振動(dòng)的組合帶[9]，1 450 nm歸屬于O—H伸縮振動(dòng)的一級(jí)倍頻，和蒼術(shù)顆粒劑中存在的水分有關(guān)[8]，1 480 nm附近歸屬于O—H伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻[9]。1 250～1 680 nm含有的信息和蒼術(shù)顆粒劑中的氨基酸有關(guān)。

圖1 蒼術(shù)顆粒劑(a)薄層色譜鑒定結(jié)果，(b)平均高光譜

2.2 不同廠家蒼術(shù)顆粒劑全波段建模區(qū)分及特征波長優(yōu)化

2.2.1 CARS及RF

基于全波段所建立的判別模型，KNN模型的總體判別率為96%，Kappa系數(shù)為0.937 8。BPNN，LS-SVM以及PLS-DA模型判別率都為100%，Kappa系數(shù)為1。

隨樣本運(yùn)行次數(shù)增加，所選特征波長數(shù)目先迅速減少，隨后趨于平緩，見圖2(a)，表明在CARS中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速選擇、雙階段選擇及精選選擇。由圖2(b)可以看見，隨樣本運(yùn)行次數(shù)增加，消除了部分冗余信息后RMSECV開始緩慢減少；當(dāng)樣本運(yùn)行次數(shù)為25次后，消除了部分關(guān)鍵波長下的光譜信息RMSECV開始緩慢增長；圖2(c)中“*”線表示RMSECV達(dá)最低值之最佳點(diǎn)，當(dāng)樣本運(yùn)行25次時(shí)，RMSECV值最小，獲得19個(gè)特征波長。RF方法可檢測(cè)每個(gè)波長下高光譜信息對(duì)不同廠家蒼術(shù)顆粒劑區(qū)分的重要性。波長被選擇幾率越大，表明該波長下高光譜信息與不同廠家的蒼術(shù)顆粒劑樣本區(qū)分的相關(guān)性可能較大[見圖2(d)]。基于RF方法將波長被選擇的概率從大到小排列，篩選出前10個(gè)波長組成波長數(shù)目從1～10的10組數(shù)據(jù)，并建立判別模型[圖2(e)和圖2(f)]。隨著波長數(shù)目的增加，模型的總體判別率以及Kappa系數(shù)總體均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)波長數(shù)目大于等于5時(shí)，除KNN外的另外三種模型總體判別率均達(dá)到了100%、Kappa系數(shù)達(dá)到了1且保持恒定。

2.2.2 相關(guān)性分析及優(yōu)化的波段

繼續(xù)計(jì)算選擇出的兩個(gè)敏感波長之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，兩個(gè)波長相關(guān)系數(shù)的值高于0.9的，只保留一個(gè)。

經(jīng)CARS-CA，RF-CA，SFS-CA以及SPA-CA分別篩選得到了4個(gè)、2個(gè)、4個(gè)以及3個(gè)最佳波長(表1)。

954 nm歸屬于C—H，N—H，O—H伸縮振動(dòng)的三級(jí)倍頻[10]，975，1 476和1 483 nm歸屬于O—H伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻[11]，1 005 nm歸屬于N—H伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻[9]，1 122 nm歸屬于C—H伸縮振動(dòng)[12]，1 220，1 126，1 146，1 237，1 294，1 348，1 365和1 368 nm為C—H的伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻[13]，1 372 nm歸屬于1 412 nm，1 415 nm歸屬于芳香烴的C—H拉伸振動(dòng)[14]。

CARS選擇的特征波長，在1 100～1 300，1 360～1 420以及1 430～1 480 nm位置，和相關(guān)性分析結(jié)果一致。CARS-CA，RF-CA，SFS-CA和SPA-CA得到的最優(yōu)波長分別有2個(gè)(1 220和1 476 nm)，1個(gè)(1 442 nm)，1個(gè)(1 584 nm)、1個(gè)(1 146 nm)，均分布在對(duì)應(yīng)的平均光譜差異度較大的區(qū)域，見圖3(a,b,c)。其中1 476，1 442與1 584 nm的信息都和蒼術(shù)顆粒劑中的氨基酸有關(guān)。

圖2 (a)CARS采樣變量數(shù)量的變化趨勢(shì)，(b)RMSECV值，(c)隨著采樣運(yùn)行的增加每個(gè)變量的回歸系數(shù)，(d)通過RF選擇特征波長的結(jié)果，不同波長數(shù)目下不同模型的(e)總體判別率和(f)Kappa系數(shù)

圖3 蒼術(shù)顆粒劑廠家區(qū)分研究中(a)初步篩選特征波長，(b)CA篩選波長選擇結(jié)果，(c)基于CARS選擇的敏感波長之間的相關(guān)性分析

表1 基于高光譜技術(shù)的蒼術(shù)顆粒劑廠家區(qū)分特征波段選擇

2.3 基于特征波長建立的判別模型

基于CARS-CA，RF-CA，SFS-CA和SPA-CA選擇的最優(yōu)波長，和原始數(shù)據(jù)的256個(gè)波長變量相比，分別減小了98.44%，99.22%，98.44%和98.83%的變量，大大增加了模型的運(yùn)算效率。

從表2可知，基于四種最佳波段建立的KNN以及BPNN模型的總體判別率均沒有達(dá)到100%，Kappa系數(shù)也沒有達(dá)到1?；谒慕M最佳特征波長建立的PLS-DA以及LS-SVM模型的總體判別率為100%以及Kappa系數(shù)為1的占比分別為25%以及50%，可以得出LS-SVM模型判別效果優(yōu)于其他三種?；贑ARS-CA所建立的四種模型，總體判別率為100%以及Kappa系數(shù)為1的占比為50%，優(yōu)于其他三組最佳特征波長。綜上所述，CARS-CA-LS-SVM模型在總體判別率為100%以及Kappa系數(shù)為1的情況下，大大減少了模型的輸入變量，提高了運(yùn)算效率，為區(qū)分不同廠家蒼術(shù)顆粒劑的最優(yōu)模型。

表2 基于特征波長建立的區(qū)分不同廠家蒼術(shù)顆粒劑的模型判別Table 2 Model discrimination based on characteristic wavelengths in the distinguish study of Atractylodes Lancea granules from different manufactures

圖4 基于CARS-CA-LS-SVM模型的不同廠家蒼術(shù)顆粒劑區(qū)分結(jié)果圖

2.4 基于最優(yōu)模型建立的判別模型結(jié)果可視化

所有的蒼術(shù)顆粒劑樣本都能被正確識(shí)別(如圖4所示)，并且很容易與其他廠家區(qū)分。然而，廠家B的蒼術(shù)顆粒劑樣本有4個(gè)樣本的一些像素點(diǎn)被預(yù)測(cè)成了廠家C，本來應(yīng)該被預(yù)測(cè)為黃色的一些像素點(diǎn)被預(yù)測(cè)成了紅色。其原因可能是該像素點(diǎn)的光譜攜帶了超出廠家C范圍的蒼術(shù)顆粒劑信息，當(dāng)使用基于樣本平均譜的模型來預(yù)測(cè)相應(yīng)的像素譜時(shí)，這些光譜特征會(huì)偏離樣本平均譜的預(yù)測(cè)集。整體來看，4個(gè)樣本所有像素點(diǎn)的顏色，還是預(yù)測(cè)為廠家B黃色的像素點(diǎn)較多，是準(zhǔn)確的。

不同廠家蒼術(shù)顆粒劑的區(qū)分可視化是基于最優(yōu)模型和特征波長建立的魯棒性和代表性的判別模型，結(jié)果證明是可行的。為今后開發(fā)蒼術(shù)顆粒劑和其他中藥的綜合質(zhì)量實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供了可能。

3 結(jié) 論

高光譜技術(shù)結(jié)合CARS和CA法進(jìn)行二次特征波長選擇，可有效實(shí)現(xiàn)不同廠家的蒼術(shù)顆粒劑可視化判別，實(shí)現(xiàn)了三個(gè)不同廠家蒼術(shù)顆粒劑的區(qū)分。剔除不相關(guān)或非線性變量的輸入變量，降低了計(jì)算量，提高了運(yùn)算效率，為解決蒼術(shù)顆粒劑的無損質(zhì)量控制和產(chǎn)品溯源問題提供了參考。為開發(fā)基于特征波長的中藥制劑產(chǎn)品溯源多光譜檢測(cè)系統(tǒng)提供了科學(xué)支持。

下一步將進(jìn)行更多生產(chǎn)廠家區(qū)分以研究參數(shù)的有效性，并擬擴(kuò)大樣本數(shù)做進(jìn)一步驗(yàn)證和完善以建立更穩(wěn)定、更普遍適用的判別模型。