張夢迪 ,杜金城 ,杜鋼軍*

1.河南大學藥學院 藥物研究所,河南 開封 475004;2.湖南中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院,長沙 410208

川楝子,楝科植物川楝(MeliatoosendanSied.etZucc.)的干燥成熟果實,性寒、味苦、有小毒,具有舒肝、行氣止痛和驅(qū)蟲的功效,適用于肝郁化火、胸脅、脘腹脹痛、疝氣疼痛、蟲積腹痛。臨床上主要用于胃病、脅痛、急性乳腺炎、乳癰、帶狀皰疹、前列腺炎等[1]。關(guān)于川楝子驅(qū)蟲、抗病毒、抗氧化、鎮(zhèn)痛等方面藥理作用已有相關(guān)研究,抗炎方面還未有詳細報道。因此,基于網(wǎng)絡藥理學的分析方法,以此來觀察川楝子藥物與藥理網(wǎng)絡之間的相互影響[2]。

中藥具有多組分、多靶點、協(xié)同作用等特點[3],運用網(wǎng)絡藥理學對中藥活性成分鑒定與篩選,可為中藥的藥理活性研究提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)[4-5]。本研究在證明川楝子有良好的抗炎作用的基礎(chǔ)上,通過網(wǎng)絡藥理學的方法對川楝子的抗炎作用機制進行分析,為進一步研究其抗炎成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品及試劑

藥物:川楝子原藥材,購于開封市天濟大藥房,經(jīng)河南大學藥學院叢悅教授鑒定為楝科植物川楝(MeliatoosendanSied.etZucc.)的干燥成熟果實。

川楝子水煎液制備:稱取40 g川楝子原藥材,加800 mL的蒸餾水浸泡1 h,煎煮30 min,濾出藥液,再以相同方式連續(xù)煎煮2次。合并3次藥液加熱濃縮至200 mL,得到川楝子水煎液,每1 mL 水煎液含生藥量0.2 g,分裝凍存于-80 ℃冰箱,臨用前蒸餾水稀釋到所需濃度。

試劑:二甲苯500 mL(天津市富晨化學試劑廠,批號20160812)。

1.2 儀器

微量移液器(上海佳安分析儀器廠);FA1004B型電子天平(上海越平科學儀器有限公司);WH-866渦旋振蕩器(太倉市科教器材廠)。

1.3 實驗動物

健康雄性昆明小鼠,體質(zhì)量(26±2)g,由河南省醫(yī)學實驗動物中心提供,許可證號SCXK(豫)2015-0002,實驗動物合格證號:No.41000100002406,所有動物使用均經(jīng)河南大學動物實驗倫理委員會批準,許可號:HUSAM2016-288。

1.4 分析平臺與軟件

①中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(http://Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php);②Uni-Prot 數(shù)據(jù)庫 (https://www.uniprot.org/);③PubChem 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/);④Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/);⑤STITCH(http://stitch.embl.de/);⑥蛋白質(zhì)相互作用分析平臺STRING (https://string-db.org/);⑦人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID v6.8(https://david.ncifcrf.gov/);⑧網(wǎng)絡圖形拓撲分析與編輯軟件Cytoscape3.2.1。

2 方法

2.1 二甲苯誘導的小鼠耳腫脹

小鼠20只,隨機分為2組,每組10只:對照組和川楝子組。川楝子組按小鼠體重4 g/kg(人體表面積等效劑量)灌胃川楝子水煎液,對照組以相同容量灌胃生理鹽水,每天1次,連續(xù)10 d。第10天小鼠給藥30 min后,于各組小鼠右耳正反面均勻涂上二甲苯40 mL 致炎,左耳做對照。涂上二甲苯30 min后,脫臼法處死小鼠,剪下同只小鼠左右耳用直徑8 mm 打孔器在同一部位打下耳片,分析天平稱重,以兩耳片重量差值為耳腫脹度,并計算腫脹抑制率。腫脹抑制率=[(模型組耳平均腫脹度-給藥組耳平均腫脹度)/模型組耳平均腫脹度]×100%[6]。

2.2 川楝子活性成分搜集與篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中選擇“Herb name”項,檢索框中輸入關(guān)鍵詞“川楝子”,得到川楝子所含化合物,根據(jù)分子類藥性(DL)來進行篩選。本研究以DL≥0.18作為篩選條件,對檢索到的川楝子化合物進行篩選,得到活性成分。并從PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得川楝子活性成分的3D 結(jié)構(gòu)。

2.3 活性成分靶點獲取及活性成分-預測靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

從TCMSP數(shù)據(jù)庫、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫及STITCH 數(shù)據(jù)庫將活性化合物對應的所有靶點導出,通過UniProt將靶點蛋白名轉(zhuǎn)變成基因名。利用Cytoscape 3.2.1 軟件進行可視化,建立川楝子活性成分-預測靶點網(wǎng)絡以探究川楝子的藥理學作用原理及機制。在構(gòu)建的網(wǎng)絡圖中,節(jié)點(node)代表活性成分、蛋白質(zhì)或基因等生物分子,節(jié)點與節(jié)點之間的連接(edge)代表生物分子之間的相互作用。一個節(jié)點的度值(degree)表示網(wǎng)絡中節(jié)點與節(jié)點相連的數(shù)目,degree越大,這個靶點則越有可能是化合物的關(guān)鍵作用靶點[7]。

2.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建及核心靶點篩選

一般情況下,蛋白質(zhì)不會以獨立個體的形式實現(xiàn)其生物學功能,而是與其他蛋白通過彼此相互作用,以大分子復合物的形式完成生物學功能,因此蛋白質(zhì)相互作用的研究、分析是理解生命活動中分子功能、細胞組織、生物過程和信號通路不可缺少的基礎(chǔ)條件[8]。為了使靶點蛋白在系統(tǒng)層面的作用更好地表現(xiàn)出來,將活性成分對應的靶點信息導入STRING 數(shù)據(jù)庫,限定物種為“Homo sapiens”,獲得PPI的相關(guān)信息。從STRING 中下載Excel表格數(shù)據(jù),置信度設為≥0.9,將篩后結(jié)果導入Cytoscape 3.2.1中,利用CytoNCA 進行分析,篩出核心靶點。

2.5 靶點通路注釋分析

利用DAVID 生物信息學資源數(shù)據(jù)庫,對獲取的川楝子相關(guān)靶點信息進行GO 生物功能和KEGG 通路富集分析,得到靶點相對應的功能分布及生物學通路。

2.6 活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡構(gòu)建

根據(jù)得到的川楝子活性成分信息、核心靶點信息及通路信息,利用Cytoscape軟件中的Merge功能構(gòu)建活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism-5統(tǒng)計軟件分析處理,實驗數(shù)據(jù)以±s表示,采用單因素方差分析和t檢驗。P<0.05,表示組間有顯著差異。

3 結(jié)果

3.1.川楝子的抗炎作用

取小鼠耳片稱重后,進行數(shù)據(jù)分析。對照組耳腫脹度為(0.016 2±0.000 7)g,川楝子組耳腫脹度為(0.006 2±0.000 3)g,腫脹抑制率為61.7%(P≤0.05)。實驗結(jié)果顯示,川楝子有顯著的抗炎作用。

3.2 川楝子活性成分篩選

從TCMSP中共獲得化合物33個,根據(jù)DL>0.18篩選出活性成分18個,見表1。甘露醇(Mandenol)、亞麻酸乙酯(Ethyl linolenate)、β谷甾醇(βsitosterol)、印楝波為定C(Nimbolidin C)、川楝素(Toosendanin)、豆甾醇(Stigmasterol)、苦楝子酮(Melianone)、印楝波為定D(Nimbolidin D)、異槲皮甙(ISOQUERCITRIN)、印楝波為定A(Nimbolin A)、三聚四氟乙烯(Thujopsadiene)、脫氫二苯基醛((+)-Dehydrodiconiferyl aldehyde)、楝葉吳萸素B(evofolin-B)、皮樹脂醇(Medioresinol)、蘆丁(Rutin)、甜菜酸(Melissic acid)、槲皮素(Quercetin)、正三氯硝醇(n-Triacontanol)。

表1 川楝子活性成分

3.3 川楝子活性成分-靶點蛋白網(wǎng)絡構(gòu)建

獲得281個靶點蛋白,通過Uniprot將蛋白名全部轉(zhuǎn)變成基因名。導入Cytoscape軟件后,得到川楝子活性成分-靶點網(wǎng)絡,見圖1。該網(wǎng)絡包含299個節(jié)點(nodes)和468條邊(edges),節(jié)點代表化合物與靶點蛋白,邊代表化合物和靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡圖中,節(jié)點的度值(degree)代表與之相連的路線條數(shù),各節(jié)點對應的參數(shù)值越大,則說明其在網(wǎng)絡中的樞紐作用越重要[9]。從圖1中可以看出同一靶點連接多個活性成分,充分體現(xiàn)了川楝子多成分、多靶點的作用特點。

3.4 川楝子靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)構(gòu)建與分析

使用STRING 數(shù)據(jù)庫,導入已獲得的川楝子預測靶點蛋白,限定物種為人源(Homo sapiens),得到靶點蛋白相互作用的相關(guān)數(shù)據(jù),下載數(shù)據(jù)文件,設置置信度≥0.9進行篩選。將篩后數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件,繪制相互作用網(wǎng)絡圖并篩選核心靶點,導出拓撲數(shù)據(jù),代表預測靶點蛋白,代表核心靶點,見圖2。共涉及219個節(jié)點,1 106條邊。設置節(jié)點度值degree≥36篩選得到4個核心靶蛋白,見表2。轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α同種型(PIK3CA)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)。最終結(jié)果顯示,JUN 的degree值等于54,為所有靶點之最。MAPK1和PIK3CA 的degree值分別為42和41,表明這3個節(jié)點為連通網(wǎng)絡中其他節(jié)點的橋梁,并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

3.5 川楝子靶點GO 注釋與KEGG 通路分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫,對川楝子靶點蛋白進行生物功能注釋分析(GO)和信號通路分析(KEGG),當P≤0.05時被認為顯著富集,以此為條件進行篩選,GO 生物功能注釋為34 個、KEGG 通路為63條。經(jīng)過分析可知,GO 結(jié)果顯示,川楝子的靶點蛋白主要涉及Fc-epsilon受體信號通路、細胞增殖的積極調(diào)節(jié)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶信號、凋亡過程的負調(diào)節(jié)、血管生成、MAPK 級聯(lián)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)節(jié)等生物學功能,見表3。KEGG 通路富集顯示,川楝子的抗炎靶點蛋白主要與MAPK 信號通路、B細胞受體信號通路、T 細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路等通路功能有關(guān),見表4。

圖1 川楝子活性成分-靶點蛋白網(wǎng)絡

表2 核心靶點蛋白

圖2 川楝子靶點蛋白-蛋白相互作用圖

3.6 川楝子活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡圖分析

使用Cytoscape軟件中的Merge功能構(gòu)建川楝子活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡,顯示川楝子活性成分與靶點以及相關(guān)作用通路之間的關(guān)系,見圖3。從圖3中可以看出,川楝子阻止炎癥通路的共同組分是川楝素、斛皮素及印楝波利丁C。

表3 GO 生物過程

續(xù)表3

4 討論

動物炎癥模型是篩選和評價抗炎藥物的有效手段。本研究采用小鼠耳腫脹實驗表明,川楝子水煎液對實驗小鼠有明顯抗炎作用。網(wǎng)絡藥理學為分析中藥材多組分疾病防治機制提供了強大的工具。利用網(wǎng)絡藥理學方法,我們篩出川楝子18種活性成分及281個預測靶點,PPI顯示靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系,篩選出4 個核心靶點分別為JUN、MAPK1、PIK3CA 和RELA。其中,JUN 為原癌基因靶點蛋白、MAPK 是一類進化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶,在由機體細胞內(nèi)在促炎細胞因子或者細胞外界物理刺激等所引發(fā)的級聯(lián)反應中起重要作用。它們調(diào)控著許多生理活動,與機體炎癥密切相關(guān)等[10]。PIK3CA 蛋白陽性表達率與高危型HPV感染率及宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[11],也與炎癥密切相關(guān)。KEGG 顯示,預測的川楝子抗炎靶點主要富集在MAPK 信號通路、Toll樣受體信號通路和TNF信號通路等。已有報道[12]研究,MAPK 信號傳導介導炎癥反應;腫瘤壞死因子TNF 在細胞相關(guān)的增殖、分化等生物過程及免疫和炎癥反應方面起著不容忽視的作用;Toll樣受體信號通路可誘導炎癥因子的表達等,這可能是川楝子抗炎的主要機制。川楝子活性成分-核心靶點-通路網(wǎng)絡顯示川楝子阻止炎癥通路的共性成分是川楝素、斛皮素及寧玻利丁C,與文獻[13-14]報道的研究內(nèi)容相符。有研究[15]表明,經(jīng)過不同方法炮制的川楝子,抗炎鎮(zhèn)痛的作用有所區(qū)別,而導致這種不同的內(nèi)在因素及深層機制機理,需要結(jié)合已獲得的靶點、生物途徑及信號通路進行探究。

綜上所述,川楝子抗炎活性成分可能是川楝素、斛皮素及寧玻利丁C,其抗炎作用可能與影響JUN、MAPK1、PIK3CA、RELA 等靶點蛋白阻止MAPK 信號、TNF信號及Toll樣受體等炎癥通路有關(guān)。