暢引東，譚再鈞，董海龍，任文勇，李新鳳，王建明*

(1.山西農業(yè)大學 植物保護學院,山西 太谷 030801;2.吉林省延邊州和龍市農業(yè)農村局,吉林 和龍 133500)

層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)是一種重要的植物病原真菌,可侵染玉米引起莖基腐、穗腐和鞘腐等多種病害[1]。真菌由于個體小、繁殖快等原因,極容易發(fā)生遺傳變異[2]。這使得原先致病力極強的野生真菌菌株在實驗室條件下擴繁多次后,往往會出現(xiàn)致病力減弱或完全喪失的退化現(xiàn)象。真菌致病力喪失問題給試驗研究的正常開展造成了許多不利的影響。因此,明確連續(xù)移植對菌株遺傳變異的影響對今后如何避免此類問題有積極的指導意義。

真菌的遺傳變異與其特有的生殖方式有關。真菌可通過無性繁殖進行大量的擴繁,而有性生殖或某些真菌特有的準性生殖賦予其對環(huán)境強大的適應能力[3]。長期以來正是這種能力使其在生長環(huán)境改變、病毒侵染等外界因素影響下基因發(fā)生了重組或抑制了某些基因的表達,使細胞內酶合成能力下降,導致菌株退化變異[1～4]。目前,對植物病原真菌在實驗室條件下菌株退化方面的研究較少,多數(shù)研究是針對用于生防的蟲生真菌和大型食用真菌的菌種退化問題。而這些研究大多是針對繼代培養(yǎng)或連續(xù)移植對菌株的生長性狀及致病力變化的影響等,并沒有對菌株生長性狀或致病力發(fā)生改變的原因做出進一步解釋[4-8]。

有關真菌生物學特性和致病性的變異研究,大多集中在菌株因長期環(huán)境條件改變對其表型變化的影響方面,但有關其與相關分子水平上的相互聯(lián)系的研究報道較少。有研究表明尖孢鐮孢菌西瓜專化型菌株經連續(xù)移植多次后出現(xiàn)的菌落角變與DNA甲基化有關[9]。菌株的退化變異是否與其遺傳分化有關,尚未有報道。ISSR分子標記技術被廣泛應用于真菌的遺傳分化研究,其反映出的遺傳多態(tài)性與菌株致病力分化、培養(yǎng)性狀等有一定的相關性[10,11]。因此,本試驗研究了層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的生物學特性與ISSR遺傳多樣性變化的相互關系，以期闡釋連續(xù)移植對該菌株的影響,為進一步揭示鐮孢菌的致病分子機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為從玉米莖基腐病嚴重發(fā)生的罹病植株上分離鑒定的層出鐮孢菌致病菌株[12,13]。

1.2 菌株連續(xù)移植

對采用稀釋法獲得的單孢分離菌株進行移植。每間隔4 d挑取菌落邊緣菌絲移植,置于人工氣候箱中25 ℃恒溫培養(yǎng),共移植20代次,獲得的菌株生長4 d后儲存于4 ℃菌種保藏箱[12]。

1.3 連續(xù)移植菌株生物學特性的研究

1.3.1 連續(xù)移植菌株菌落形態(tài)的觀測 選取第1、5、10、15、20次移植的層出鐮孢菌菌株,轉接于PDA培養(yǎng)基。每個菌株設3次重復,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。在接種后的第2～7天以十字劃線法測量PDA培養(yǎng)基上菌落直徑,測算菌株的菌絲生長速率,并使用SPSS軟件進行不同次移植菌株間菌絲生長速率的差異顯著性分析[12]。選取第1、10、20次移植的菌株,在培養(yǎng)4 d、7 d、30 d后,分別對其菌落形態(tài)進行記錄并拍照。

1.3.2 連續(xù)移植菌株顯微形態(tài)的觀察 選取第1、10、20次移植的菌株,分別在培養(yǎng)4 d、7 d和30 d后,在顯微鏡下觀察菌株小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子、產孢梗和分生孢子座的數(shù)量、大小和形狀等,記錄并拍照[13]。

1.3.3 連續(xù)移植菌株產孢量的測定 選取第1、10、20次移植的菌株,轉接于綠豆湯培養(yǎng)液中,放置于搖床中培養(yǎng)4 d,溫度設置為25 ℃,轉速設置為150 r/min。在第5天,用血球計數(shù)板進行孢子量的測定,每個菌株測定3次,取平均值，并使用SPSS軟件進行不同次移植菌株間孢子量的差異顯著性分析。

1.4 連續(xù)移植菌株致病力的測定

選用經前期試驗鑒定的玉米感病品種為寄主,將其種子浸入含2%有效氯的次氯酸鈉消毒液中,在搖床中以150 r/min振蕩消毒15 min,用無菌水清洗3～5次后,再在55 ℃無菌水中浸種10 h。然后將玉米種子置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行催芽。待玉米種子長出約1.5 cm根或0.5 cm芽后進行菌株接種。

選取發(fā)芽一致的玉米種子，分別浸入層出鐮孢菌第1、10和20次移植菌株的106個/mL孢子懸浮液中,15 min后將其播種于裝有無菌土的塑料箱(長35 cm,寬25 cm,深15 cm)中,每箱播種15粒種子,覆蓋無菌土厚度2～3 cm,以無菌水浸種為空白對照[14]。將培養(yǎng)塑料箱放入光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),白天溫度設為25 ℃,光照12 h,光照強度為12000 lx;夜間溫度設為15 ℃,時長為6 h。在播種30 d后,按照玉米莖基腐病病情指數(shù)進行病情調查[15]。

1.5 連續(xù)移植菌株遺傳多樣性的研究

選取層出鐮孢菌第1～5、第8～12和第16～20次移植的菌株,采用改良的CTAB法[16]進行基因組DNA的提取。選用何婧等[17]篩選的3個ISSR引物812、831和888,并參考其PCR擴增程序及PCR反應體系,分別進行PCR擴增。采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測,并用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄。將PCR擴增的DNA條帶轉換成二進制數(shù)據(jù),有帶的記為1,無帶的記為0,統(tǒng)計成0/1矩陣。利用NTSYSpc (Version 2.10e)軟件進行聚類分析并構建系統(tǒng)聚類圖[18]。

2 結果與分析

2.1 連續(xù)移植菌株的生物學特性

2.1.1 連續(xù)移植菌株的菌落形態(tài) 層出鐮孢菌第1、10、20次移植菌株在PDA培養(yǎng)基中生長4 d、7 d和30 d后的菌落形態(tài)見圖1。從圖1中可以看出,層出鐮孢菌第1代菌株與第10代、第20代菌株在菌落形態(tài)和菌落顏色上無明顯差異,最初幾天菌落顏色為白色,隨著培養(yǎng)時間的延長會在菌落中心產生淡紫色菌絲;該菌株第1代與第10代、第20代菌株在基物顏色上略有差異,第1代菌株的基物顏色隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸變深,在第30天時產生深藍色菌核,而第10代和第20代菌株在各培養(yǎng)時期的基物顏色相對于第1代菌株而言較淡,未形成深藍色菌核。

圖1 層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的菌落形態(tài)

層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d時的菌落直徑及菌絲生長速率見表1。從表1可知,層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的菌落直徑和菌絲生長速率隨移植次數(shù)的增加呈下降趨勢。

表1 層出鐮孢菌的菌落直徑及菌絲生長速率

2.1.2 連續(xù)移植菌株的顯微形態(tài) 層出鐮孢菌不同次移植菌株的顯微形態(tài)觀察結果如表2和圖2所示。結果表明：層出鐮孢菌第1、10、20次移植菌株在分生孢子和產孢梗的數(shù)量和顯微形態(tài)等方面沒有明顯的差異。層出鐮孢菌不同次移植菌株在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d后,未能發(fā)現(xiàn)大孢子、產孢梗和厚垣孢子；在培養(yǎng)7 d后的部分菌株中發(fā)現(xiàn)了大小孢子及厚垣孢子；在培養(yǎng)30 d后可大量發(fā)現(xiàn)大小孢子、產孢梗、厚垣孢子,分生孢子座也有發(fā)現(xiàn)(表2)。從圖2中可以看出,層出鐮孢菌不同次移植菌株的大小分生孢子、產孢結構、厚垣孢子及分生孢子座的形態(tài)、大小等未見明顯差異。

a:小孢子；b:大孢子；c:分生孢子座和大孢子；d:產孢梗；e:假頭狀；1、10、20指移植次數(shù)。圖2 層出鐮孢菌不同代連續(xù)移植菌株的顯微形態(tài)

表2 層出鐮孢菌不同代連續(xù)移植菌株在不同培養(yǎng)時期的顯微形態(tài)統(tǒng)計結果

2.1.3 連續(xù)移植菌株的產孢量 層出鐮孢菌不同次移植菌株在綠豆湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d后的孢子產量詳見表3。從表3中可知,層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株的產孢量隨著移植次數(shù)的增加呈明顯的下降趨勢,由第1代的322400000個/mL下降到第20代的198400000個/mL。

表3 層出鐮孢菌不同代連續(xù)移植菌株的產孢量

2.2 連續(xù)移植菌株的致病力

連續(xù)移植層出鐮孢菌菌株對玉米幼苗的致病力結果詳見表4和圖3。從表4可以看出,經連續(xù)移植的菌株雖然均能導致玉米苗期發(fā)病,但不同次移植菌株對幼苗的致病力呈遞減趨勢,其中第1次移植層出鐮孢菌的致病力最強,接菌后幼苗的病情指數(shù)達41.0；第20次移植菌株接菌后幼苗的病情指數(shù)只有36.6。從圖3玉米幼苗的長勢可見：接種層出鐮孢菌的玉米幼苗在長勢和出苗率上略低于空白對照CK,發(fā)病較輕；接種第1代層出鐮孢菌的玉米幼苗相對于接種其它代菌株的幼苗而言較稀疏和矮小。

表4 不同代連續(xù)移植菌株的致病力

圖3 連續(xù)移植菌株處理后玉米幼苗的長勢

2.3 連續(xù)移植菌株的遺傳多樣性

選取的15個層出鐮孢菌不同次移植菌株的遺傳相似性系數(shù)和聚類圖分別見圖4和表5。從圖4可以看出,在層出鐮孢菌連續(xù)移植菌株間基因組DNA在簡單重復序列間區(qū)的遺傳分化明顯,菌株間存在豐富的遺傳多樣性。但是結合表5和圖4,分別從第1～5、8～12和16～20次連續(xù)移植菌株來看,可發(fā)現(xiàn)移植次數(shù)相鄰菌株間的遺傳距離相近，例如：表5中4代次菌株與5代次間、10代次與11代次間、16代次與17代次間的遺傳相似性系數(shù)在各自菌株范圍內較高,分別為1、1和0.93。從圖4中也可觀察到部分移植次數(shù)相鄰菌株被劃歸為一個類群,例如,2代次與3代次、4代次與5代次、10代次與11代次、11代次與12代次、16代次與17代次菌株。由此可知不同菌株在遺傳分化時移植次數(shù)相近菌株間的遺傳分化力度較小。在遺傳分化過程中,除少數(shù)菌株如1代次和9代次菌株外,大多數(shù)移植次數(shù)相差大的菌株間遺傳相似性系數(shù)較低(表5)。

表5 層出鐮孢菌繼代培養(yǎng)菌株不同代次間的遺傳相似性系數(shù)

3 結論與討論

本試驗對層出鐮孢菌不同移植次數(shù)菌株的菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和致病性等生物學特性，以及ISSR遺傳多樣性等方面進行了研究。結果表明：經連續(xù)移植的層出鐮孢菌菌株的菌落形態(tài)無明顯差異,培養(yǎng)基基物顏色隨著移植次數(shù)增多而逐漸變淡,菌株的產孢量、致病力和菌絲生長速率隨著培養(yǎng)次數(shù)增多而下降;層出鐮孢菌不同次移植菌株間遺傳分化明顯,但在移植次數(shù)相近菌株間的遺傳分化力度較?。坏荌SSR分子標記所反映出的菌株間遺傳分化與菌株間表現(xiàn)出的生物學特性無明顯的相關性。綜合來看,隨著連續(xù)移植次數(shù)的增加，層出鐮孢菌的擴繁力和致病力均下降,出現(xiàn)了明顯的退化現(xiàn)象。

對菌株菌落形態(tài)、顯微形態(tài)和產孢量的測定可以從宏觀上明確菌株的生長情況,從而進一步了解不同代次菌株間的生長變異情況。對菌株致病力的測定可以從另一個方面反映出菌株的生物學性狀。劉海英等對玉米大斑病菌繼代培養(yǎng)菌株的研究表明，隨著轉接次數(shù)的增加,菌株的菌絲生長速度、產孢量、分生孢子大小及致病性均呈顯著下降趨勢[5]。諸多研究發(fā)現(xiàn),許多經連續(xù)移植或繼代培養(yǎng)菌株的產孢量均會出現(xiàn)明顯的下降趨勢[5,8,19,20]。菌株的這些生物學性狀是由基因調控的。那些在形態(tài)和致病性上有差異的菌株間,其差異是否由基因上的差異造成的？這需要從分子生物學的角度做多層次的研究。本試驗采用ISSR遺傳多樣性研究方法探索了層出鐮孢菌菌株退化的原因,結果表明該病原菌不同次移植菌株間具有明顯的遺傳分化,但是基于ISSR-PCR結果所反映出的菌株間遺傳分化與本試驗中所測定的菌株生物學指標無明顯的相關性,無法據(jù)此對菌株各生物學指標差異與特定基因的關聯(lián)性做進一步的研究。秦敏等通過RAPD分子標記對不同致病力稻瘟病菌繼代培養(yǎng)菌株的遺傳穩(wěn)定性進行了研究,結果發(fā)現(xiàn)強致病菌繼代培養(yǎng)菌株的致病性變異大,其DNA的遺傳變異也較大,而弱致病菌繼代培養(yǎng)菌株的致病性和DNA遺傳變異均較小[6]。有些研究表明基于ISSR分子標記的鐮孢菌遺傳分化與菌株致病性有一定的相關性[10,21～23],但在本研究中未能反映出這種相關性,我們在對連續(xù)移植禾谷鐮孢菌進行ISSR遺傳多樣性研究時也得到了相似的結果[14]。研究人員對在棉花和水瓊脂培養(yǎng)基中連續(xù)移植的尖孢鐮孢菌萎蔫專化型的致病力和遺傳分化進行研究時發(fā)現(xiàn)AFLP分子標記所反映出的遺傳分化與菌株致病力的增加無明顯的相關性[24]。一般來說,病原真菌在經歷有性生殖或準性生殖之后,其遺傳特性會因生長環(huán)境變化而產生變異,而真菌的無性生殖是為了在短期內大量擴繁,其遺傳變異較少。由此可見經過連續(xù)移植的菌株僅僅是發(fā)生退化,其產生變異的可能性較低,而與菌株退化相關的DNA遺傳差異還有待于進一步的研究。