解云峰

上海市工業(yè)微生物研究所，上海 200233

L-谷氨酰胺是人體內(nèi)重要而豐富的氨基酸之一，占人體內(nèi)總游離氨基酸的61%，人體內(nèi)的L-谷氨酰胺主要生成并儲(chǔ)存在肌肉中，是人體健康的必需，在科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，得到了越來(lái)越廣泛的重視和應(yīng)用[1,2]。為了提高谷氨酰胺的產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)菌種培養(yǎng)基pH進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以較大幅度提高谷氨酰胺的產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 菌種

黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)366[3]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1斜面培養(yǎng)基

牛肉膏1.0%，蛋白胨 1.0%，NaCl 0.5%，瓊脂 2.0% ，pH 7.6。

1.2.2搖瓶種子培養(yǎng)基

葡萄糖 5.0%，尿素 0.5%，KH2PO40.1%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.04%， 玉米漿 3%，pH 7.6。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 12%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.05%，Mn++10 mg/L，Zn++1.0 mg/L，玉米漿 1%，(NH4)2SO47%(分消)，pH 6.0。

1.3 試劑和儀器

1.3.1試劑

玉米漿(上海葡萄糖廠提供)，PH6.4-8.0試紙(上海試劑四廠產(chǎn))，L-谷氨酰胺樣品(SICMA)，其余均為國(guó)產(chǎn)試劑(化學(xué)純)。

1.3.2儀器

721型分光光度計(jì)，SKW-3型微量呼吸檢壓儀，pH計(jì)，往復(fù)式無(wú)節(jié)調(diào)速搖床(上海工業(yè)微生物研究所提供)，發(fā)酵罐 NBS公司 SF-116型自控罐配有pH電極和溶氧電極。

1.4 培養(yǎng)條件

恒溫箱培養(yǎng)，30 ℃±1 ℃培養(yǎng)斜面菌種，培養(yǎng)1 d。

1.4.1搖瓶種子培養(yǎng)

1 000 mL三角瓶裝液量150 mL，接斜面種子一環(huán)，置于往復(fù)式搖床(110 r/min)，于30 ℃±1 ℃培養(yǎng)12 h。

1.4.216 L自控罐發(fā)酵培養(yǎng)

16 L自控罐裝液量8 L，118 ℃消毒5 min，冷卻后接種量3%～5%，接入發(fā)酵罐培養(yǎng)液中，根據(jù)試驗(yàn)需要控制pH，風(fēng)量，轉(zhuǎn)速，溶氧水平等。

發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)取樣，檢查有無(wú)染菌，并測(cè)定pH、殘?zhí)且约肮劝滨０樊a(chǎn)量。

1.5 分析方法

1.5.1菌體生長(zhǎng)測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液加19 mL H2O，搖勻后測(cè)定610 nm的OD值。

1.5.2谷氨酰胺測(cè)定

1.5.2.1紙層析法

發(fā)酵液經(jīng)離心除去菌體等固體物質(zhì)，在層析紙上定量點(diǎn)樣，用谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)液對(duì)照。以正丁醇、冰醋酸、水(4∶1∶1)作展開(kāi)劑。展開(kāi)完畢，吹干濾紙，用0.5%茚三酮丙酮溶液顯色。洗脫液為0.1% CuSO4·5 H2O ∶75%乙醇(2∶38)，洗脫30 min后在510 nm測(cè)OD值，并與標(biāo)準(zhǔn)谷氨酰胺比較，計(jì)算樣品中谷氨酰胺含量[4]。

1.5.2.2瓦勃氏呼吸儀法

測(cè)定樣品用堿水解前后的谷氨酸量，然后計(jì)算谷氨酰胺含量。

1.6 提高的研究發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y(cè)定

采用斐林定糖法。

1.7 pH的測(cè)定

用酸度計(jì)或精密pH試紙，發(fā)酵過(guò)程用pH電極測(cè)定[4]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1搖瓶種子培養(yǎng)基pH 7.0時(shí)，16 L發(fā)酵罐谷氨酰胺生成量(%)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 pH 7.0時(shí)16 L罐試驗(yàn)結(jié)果

2.2搖瓶種子培養(yǎng)基pH 7.6時(shí)，16 L發(fā)酵罐谷氨酰胺生成量(%)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 pH 7.6時(shí)16 L罐試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)某些嗜堿性細(xì)菌，如果適當(dāng)提高培養(yǎng)基的pH，使菌種生長(zhǎng)得更豐滿，就有可能提高其代謝物的生成量。經(jīng)過(guò)對(duì)產(chǎn)谷氨酰胺BF.366菌種的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，在16 L罐中，當(dāng)把菌種斜面培養(yǎng)基和搖瓶種子培養(yǎng)基的pH提高至7.6時(shí)，平均產(chǎn)胺達(dá)5.94%，與對(duì)照pH 7.0時(shí)平均產(chǎn)胺5.11%相比較，產(chǎn)胺提高了16%以上。