丁凡，紀(jì)翔輝，段寶榮，王全杰,2★

（1.煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 煙臺(tái)264005；2.國(guó)家制革技術(shù)研究推廣中心，山東 煙臺(tái)264005）

改革開(kāi)放以來(lái)，皮革行業(yè)快速發(fā)展，在制革過(guò)程中只有60%左右的原料皮能夠轉(zhuǎn)化為皮革產(chǎn)品，其余的則成為固體廢棄物[1]。這些固體廢棄物的主要成分為鉻和膠原蛋白，將其中的鉻鹽脫除并提取出膠原蛋白，是目前研究的主要思路[2-4]。膠原蛋白由于具有良好的絮凝性、保濕性、發(fā)泡性、粘合性、表面張力以及金屬離子鰲合性能等，在水處理、紡織業(yè)、建材、膠粘劑、制革業(yè)、造紙業(yè)以及農(nóng)業(yè)等工業(yè)領(lǐng)域中均得到了廣泛使用[5-7]。

當(dāng)使用酸法處理含鉻革屑時(shí)，高濃度的H+與膠原羧基具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，能夠與Cr3+發(fā)生爭(zhēng)奪作用，使得配合物的水解平衡向著解聚的方向進(jìn)行，且酸性條件能夠破壞分子間的鹽鍵和席夫堿，進(jìn)而使膠原纖維發(fā)生溶脹，有利于釋放出膠原蛋白[8,9]，但酸溶液會(huì)對(duì)設(shè)備造成一定的腐蝕，且產(chǎn)物中Cr3+處于溶解狀態(tài)，很難與膠原蛋白徹底分離，因此一般不單獨(dú)使用[10]。在堿性溶液中存在著大量的OH-，它具有比膠原羧基更強(qiáng)地與Cr3+發(fā)生配位的能力，從而取代膠原羧基與Cr3+反應(yīng)生成Cr(OH)3沉淀，經(jīng)過(guò)濾將其去除，堿法是目前處理含鉻廢棄物最常用的方法[11]。

本研究采用酸法預(yù)浸泡、堿法水解的方式處理含鉻革屑，將得到的水解液經(jīng)噴霧干燥制備成膠原蛋白粉，以產(chǎn)物中水分含量、灰分含量、氮含量以及含鉻量為指標(biāo)，探究符合工業(yè)使用要求蛋白粉的最佳制備工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器

實(shí)驗(yàn)材料：含鉻革屑，工業(yè)品，煙臺(tái)文登制革廠；氫氧化鈉，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；氧化鈣，分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸，分析純，煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司；硫酸鉀，分析純，天津登科化學(xué)試劑有限公司；硫酸銅，分析純，天津登科化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛，分析純，上海源葉生物科技有限公司；四硼酸鈉，分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；二硫蘇糖醇，分析純，北京索萊寶科技有限公司；過(guò)氧化氫，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴甲酚綠，分析純，天津北辰方正試劑廠；甲基紅，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：AR2140 型電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；DHG-9073 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，龍口市先進(jìn)儀器有限公司；HH-DR1 型電熱恒溫油浴鍋，上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JJ-1 型電動(dòng)增力攪拌器，龍口市先進(jìn)儀器有限公司；NDJ-5S 型循環(huán)水多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；0-90%Brix（糖）型手持糖度計(jì)，上海力辰邦西儀器有限公司；L-6000Y 型噴霧干燥機(jī)，上海皓莊儀器有限公司；K1305A 型自動(dòng)定氮儀，上海晟生分析儀器有限公司；JH752 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；TYPE SPT12 型消解爐，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司；SX2-4-10 型箱式電阻爐，龍口市先進(jìn)儀器有限公司；AA-6880 型原子吸收分光光度計(jì)，島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司；pHS-3D 型功能性pH 計(jì)，上海三信儀表廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噴霧干燥機(jī)的工作參數(shù)

本文使用噴霧干燥法對(duì)液態(tài)膠原蛋白進(jìn)行干燥，噴霧干燥機(jī)的具體工作參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 噴霧干燥機(jī)的工作參數(shù)Tab.1 Working parameters of spray dryer

1.2.2 膠原蛋白粉的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

本文中膠原蛋白粉的蛋白質(zhì)含量、水分含量、灰分含量標(biāo)準(zhǔn)參照SB/T 10634-2011《淡水魚(yú)膠原蛋白肽粉》中的規(guī)定，含鉻量以GB 13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的數(shù)值作為參考。具體標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值見(jiàn)表2。

表2 膠原蛋白粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Quality standards of collagen powder

1.2.3 堿水解條件的工藝優(yōu)化（所有試劑的加入量均按絕干革屑質(zhì)量計(jì)）

1.2.3.1 水解時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)丁凡等[12]的研究，選用復(fù)合比(%∶%)5∶3的CaO 與NaOH 作為水解用堿，固定水解溫度為90℃、液固比為6，設(shè)置水解時(shí)間分別為4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，水解完成后對(duì)水解液進(jìn)行過(guò)濾，使用濃硫酸中和至pH 值處于6～7 之間，靜置1 h 后再次過(guò)濾，收集濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至糖度約為20°Brix，將水解液進(jìn)行噴霧干燥制備成膠原蛋白粉，并對(duì)蛋白粉中水分含量、灰分含量、氮含量以及含鉻量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.2 水解溫度的單因素實(shí)驗(yàn)

在最佳水解時(shí)間下，固定液固比為6，依次改變水解溫度為75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，其余操作步驟參照1.2.3.1 進(jìn)行。

1.2.3.3 水解液固比的單因素實(shí)驗(yàn)

固定最佳水解時(shí)間和最佳水解溫度，改變水解液固比（g∶g）分別為5、6、7、8、9，其余操作步驟參照1.2.3.1 進(jìn)行。

1.2.3.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以膠原蛋白粉中灰分含量為指標(biāo)，對(duì)水解溫度、水解時(shí)間、水解液固比這三個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，探究最低灰分膠原蛋白粉的堿法制備工藝。

1.2.4 酸浸泡條件優(yōu)化（所有試劑的加入量均按絕干革屑質(zhì)量計(jì)）

1.2.4.1 硫酸加入量的探究

準(zhǔn)確稱(chēng)取40 g 絕干革屑，放入塑料容器中，向其中加入600 mL 水，依次改變濃硫酸加入量為5%、10%、15%、20%、25%，攪拌均勻，浸泡10 h 后瀝干，使用悶水洗至pH 值為6 左右，再次瀝水?dāng)Q干后置于500 mL 三口燒瓶中，在1.2.3 步得出的最低灰分堿水解工藝下水解制備膠原蛋白粉，并進(jìn)行灰分含量及含鉻量的測(cè)定。

1.2.4.2 硫酸浸泡時(shí)間的探究

固定最佳硫酸加入量，改變浸泡時(shí)間依次為12h、24 h、36 h、48 h、60 h，其余步驟參照1.2.4.1，對(duì)在最佳條件下制備出的膠原蛋白粉各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 水分含量的測(cè)定：采用直接干燥法[13]

取一定量蛋白粉放入一只干燥潔凈的250 mL燒杯中，稱(chēng)量蛋白粉與燒杯的質(zhì)量，將其置于120℃恒溫干燥箱中烘干2 h 后，置于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱(chēng)量，反復(fù)干燥至恒重，得到烘干后蛋白粉和燒杯的質(zhì)量。按公式（1）計(jì)算蛋白粉中的水分含量：

式中：

W——蛋白粉水分含量，%；

m0——燒杯質(zhì)量，g；

m1——烘干前蛋白粉與燒杯質(zhì)量，g；

m2——烘干后蛋白粉與燒杯質(zhì)量，g。

1.2.6 灰分含量的測(cè)定：灼燒法[14]

稱(chēng)取一定量烘干后的蛋白粉，置于已經(jīng)洗凈并烘干的瓷坩堝中，放入馬弗爐中后，設(shè)置升溫程序使溫度逐漸升高至580℃，繼續(xù)灼燒2 h 后取出，置于干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，取出稱(chēng)量。蛋白粉中灰分含量的計(jì)算見(jiàn)公式（2）：

式中：

A——灰分含量，%；

x1——蛋白粉質(zhì)量，g；

x2——灼燒后灰分和坩堝質(zhì)量，g；

x3——坩堝質(zhì)量，g。

1.2.7 含鉻量的測(cè)定：石墨爐原子吸收法[15]

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g 烘干后的蛋白粉置于消化管中，再向其中加入5 mL 濃硫酸，在管口處放置彎頸小漏斗，并將整個(gè)體系置于消解爐上，設(shè)置消解溫度為250℃，當(dāng)溫度升到250℃時(shí)保持10 min 后取下，稍加冷卻后滴加2 mL 雙氧水，仍在250℃下消解10 min，重復(fù)此操作，直至消解管內(nèi)液體澄清透明，繼續(xù)加熱10 min 后取下消解管，將管內(nèi)液體全部倒入100 mL 容量瓶中，使用蒸餾水定容至刻度，將其倒入石墨爐原子吸收分光光度計(jì)的樣品管內(nèi)，進(jìn)行含鉻量的測(cè)定。

1.2.8 氮含量的測(cè)定：凱氏定氮法[16]

稱(chēng)取一定量蛋白粉置于消解管中，加入5 mL 濃硫酸、0.3 g 硫酸鉀、5 滴飽和硫酸銅，輕晃搖勻后覆上彎頸漏斗，置于消解爐上，設(shè)置程序?yàn)槊扛?0 min進(jìn)行一次升溫（120℃、250℃、380℃、420℃），在420℃下保持60 min。消解結(jié)束后，待冷卻至室溫，將消解管及一只干凈的250 mL 錐形瓶安裝在定氮儀上，定氮儀的設(shè)定參數(shù)為：酸液30 mL、堿液40 mL、時(shí)間為5 min，蒸餾完成后向錐形瓶中滴加5 滴溴甲酚綠-甲基紅指示劑，使用濃度為0.1 mol/L 的鹽酸進(jìn)行滴定，滴定終點(diǎn)為液體由淡藍(lán)色變?yōu)闇\紫色。含氮量的計(jì)算如公式（3）：

式中:

ω ——含氮量，%；

c——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的濃度，0.1 mol/L；

v1——滴定管初始刻度，mL；

v2——滴定管最終刻度，mL；

m——蛋白粉的質(zhì)量，g。

1.2.9 粗蛋白含量的計(jì)算

根據(jù)氮含量的具體數(shù)值，可以由經(jīng)驗(yàn)公式（4），計(jì)算出產(chǎn)物中的粗蛋白含量。

式中：

P1——氮含量，%；

P2——粗蛋白含量，%。

1.2.10 游離氨基含量的測(cè)定

游離氨基含量的檢測(cè)方法有很多，其中OPA 法相較于其他方法具有操作簡(jiǎn)單快速、檢測(cè)結(jié)果精確等優(yōu)勢(shì)[17]，其原理是：游離氨基可以與鄰苯二甲醛（OPA）反應(yīng)形成一種黃色的絡(luò)合物，使用分光光度計(jì)能夠在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度[18]。本實(shí)驗(yàn)參照羅艷華等[16]的方法進(jìn)行蛋白粉中游離氨基含量的檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解條件的優(yōu)化

2.1.1 水解時(shí)間

圖1 水解時(shí)間對(duì)蛋白粉品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the quality of protein powder

圖1 反映了水解時(shí)間的變化對(duì)蛋白粉各項(xiàng)指標(biāo)的影響?？梢钥闯?，固定水解溫度為90℃、液固比為6 的條件下，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白粉中氮含量基本穩(wěn)定在14%左右的水平，在8 h 出現(xiàn)了灰分含量的最低值以及含鉻量快速下降的拐點(diǎn)。在鉻革屑中除了含有膠原蛋白和鉻，還包含在制革加工過(guò)程中引入的一些NaCl、Na2SO4等無(wú)機(jī)鹽，隨著水解時(shí)間的增長(zhǎng)，一部分無(wú)機(jī)鹽會(huì)溶解在水解液中，進(jìn)而過(guò)長(zhǎng)的水解時(shí)間會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物中灰分含量增多。綜合考慮，選取8 h 為最優(yōu)水解時(shí)間，此時(shí)蛋白粉產(chǎn)率為54.70%、水分含量為3.50%、灰分含量為6.67%、氮含量為14.40%、含鉻量為120 mg/kg。

2.1.2 水解溫度

圖2 水解溫度對(duì)蛋白粉品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the quality of protein powder

從圖2 中可以看出，固定水解時(shí)間為8 h、液固比為6 的條件下，隨著水解溫度的升高，蛋白粉中氮含量基本保持在穩(wěn)定水平，產(chǎn)率在90℃時(shí)出現(xiàn)最大值，含鉻量在85℃之后下降趨勢(shì)放緩，灰分含量在85℃時(shí)降至最低，超過(guò)此溫度后灰分含量開(kāi)始增大。由于水解用堿中包含CaO，在水中能夠釋放出部分Ca2+，而在水解升溫的過(guò)程中膠原蛋白不斷被降解，釋放出大量—COOH 官能團(tuán)，它能夠與Ca2+發(fā)生配位反應(yīng)，生成鈣鹽，因此過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物中灰分含量增大。綜合考慮，選取85℃為最佳水解溫度，此時(shí)蛋白粉產(chǎn)率為42%、水分含量為4.70%、灰分含量為5.78%、氮含量為14.38%、含鉻量為125.31 mg/kg。

2.1.3 液固比

圖3 反映了在固定水解時(shí)間8 h、水解溫度為85℃的條件下，水解液固比的變化對(duì)蛋白粉品質(zhì)產(chǎn)生的影響。從圖中可以看出，隨著液固比增大，蛋白粉的產(chǎn)率始終保持在43%以上，氮含量處在13.06%～14.55%的范圍內(nèi)，含鉻量在液固比處于5～7 之間時(shí)有明顯下降，之后略微上升，灰分含量在液固比為7 時(shí)降至最小值。當(dāng)液固比過(guò)小時(shí)，鉻革屑無(wú)法與堿液充分接觸，使得部分鉻革屑未能被水解，導(dǎo)致水解反應(yīng)不完全，因此在一定范圍內(nèi)隨著液固比增大，蛋白粉產(chǎn)品的含鉻量快速下降；而當(dāng)液固比過(guò)大時(shí)，水解體系中水分濃度過(guò)高，使得堿液被稀釋?zhuān)瑥亩档土怂饬Χ龋虼嗽谝汗瘫瘸^(guò)一定值后，蛋白粉灰分含量及含鉻量均有所上升。綜上，選擇最佳水解液固比為7，此時(shí)蛋白粉產(chǎn)率為48.60%、水分含量為5.20%、灰分含量為5.69%、氮含量為14.52%、含鉻量為57.30 mg/kg。

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

以灰分含量為指標(biāo)，對(duì)水解時(shí)間、水解溫度及水解液固比這三個(gè)因素進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 液固比對(duì)蛋白粉品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the quality of protein powder

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Tab.3 Analysis table of orthogonal test results

由正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，以灰分含量為指標(biāo)，各影響因素的主次關(guān)系為：水解溫度＞水解時(shí)間＞液固比，最佳參數(shù)組合為：水解時(shí)間10 h、水解溫度為95℃、液固比為6，在此條件下進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，得到蛋白粉灰分含量的平均值為5.42%，同時(shí)對(duì)此工藝下制備出蛋白粉的含鉻量進(jìn)行了檢測(cè)，其數(shù)值為52.31mg/kg。此時(shí)的含鉻量超出表2 中所列標(biāo)準(zhǔn)的最大值，且灰分含量雖在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，但仍處于較高水平。

2.2 硫酸預(yù)處理對(duì)蛋白粉品質(zhì)的影響

為了進(jìn)一步降低蛋白粉含鉻量及灰分含量，采取了硫酸浸泡的方式對(duì)鉻革屑進(jìn)行預(yù)處理。

2.2.1 酸加量

圖4 H2SO4 加入量對(duì)含鉻量和灰分含量的影響Fig.4 Effect of H2SO4 addition on chromium content and ash content

圖4 反映了在使用濃硫酸對(duì)鉻革屑進(jìn)行水解前預(yù)處理時(shí)，H2SO4加入量對(duì)蛋白粉含鉻量及灰分含量的影響?？梢钥闯龉潭ń輹r(shí)間為10 h，隨著H2SO4加入量的增加，含鉻量不斷降低，在加入量超過(guò)15%后，變化趨于平緩，且蛋白粉中灰分含量的變化幅度也在此時(shí)減弱。因此，選取15%為預(yù)處理時(shí)H2SO4的最優(yōu)加入量，此時(shí)含鉻量為20.11 mg/kg，灰分含量為5.23%。

2.2.2 預(yù)處理時(shí)間

圖5 顯示的是在固定H2SO4加入量為15%時(shí)，通過(guò)改變預(yù)處理時(shí)間對(duì)蛋白粉含鉻量及灰分含量的影響。從圖中可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)含鉻量和灰分含量均呈不斷下降的趨勢(shì)，灰分含量的整體下降趨勢(shì)相對(duì)平緩，含鉻量在12 h～24 h 內(nèi)發(fā)生了較為明顯的下降，之后波動(dòng)幅度較小?；跁r(shí)間成本考慮，選取24 h 為最佳預(yù)處理時(shí)間，此時(shí)產(chǎn)品中含鉻量為16 mg/kg，灰分含量為4.59%，且二者數(shù)值均優(yōu)于表2 中列出的標(biāo)準(zhǔn)。

圖5 H2SO4 浸泡時(shí)間對(duì)含鉻量和灰分含量的影響Fig.5 Effect of immersion time of H2SO4 on chromium content and ash content

2.3 膠原蛋白粉各項(xiàng)理化指標(biāo)

表4 膠原蛋白粉各項(xiàng)理化指標(biāo)Tab.4 Physical and chemical indexes of collagen powder

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)選用CaO 與NaOH 作為水解用堿，在固定二者的使用比為5∶3（%∶%）的條件下，分別探究了水解時(shí)間、水解溫度、水解液固比對(duì)蛋白粉中水分含量、灰分含量、氮含量以及含鉻量的影響，并通過(guò)以灰分含量為指標(biāo)的正交試驗(yàn)找到了低灰分膠原蛋白粉的堿法制備工藝。同時(shí)，為了進(jìn)一步降低蛋白粉產(chǎn)品中的灰分含量及含鉻量，使用濃硫酸對(duì)鉻革屑進(jìn)行水解前預(yù)浸泡，確定了最佳硫酸預(yù)處理?xiàng)l件。得出了以下結(jié)論：

（1）在水解溫度為95℃、液固比為6、水解時(shí)間10 h 的條件下處理含鉻革屑，制得的蛋白粉灰分含量為5.42%、含鉻量為52.31 mg/kg，此時(shí)蛋白粉中灰分含量達(dá)到工業(yè)使用標(biāo)準(zhǔn)但含鉻量過(guò)高。

（2）使用加入量為15%的濃H2SO4預(yù)浸泡24 h后，再在最佳堿水解工藝下處理含鉻革屑，得到蛋白粉產(chǎn)品的水分含量為4.60%、灰分含量為4.59%、粗蛋白含量為89.38%、含鉻量為16 mg/kg，此時(shí)灰分含量以及含鉻量均低于單純使用堿水解時(shí)制得的產(chǎn)物，因此可以確定鉻革屑在堿水解前先使用硫酸預(yù)處理，能夠有效提升制備出的蛋白粉品質(zhì)，且各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，可以在工業(yè)中使用。