于玉龍 耿宇鵬 常娜 陳高

摘 要：為探究貫葉馬兜鈴（Aristolochia delavayi）在不同地理居群揮發(fā)性成分含量的變化情況，該文采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了來自五個不同地理區(qū)域的貫葉馬兜鈴葉的揮發(fā)性成分，并用氣相色譜面積歸一化法對各成分進(jìn)行了定量。結(jié)果表明：四個貫葉馬兜鈴居群植株葉揮發(fā)性主成分均為癸烯醛，且占有較高比例。香格里拉三壩鄉(xiāng)、麗江大具、楚雄鐵鎖鄉(xiāng)和祿勸則黑鄉(xiāng)四個居群植株葉中揮發(fā)性成分癸烯醛分別占揮發(fā)性成分檢出總量的63.5%、79.3%、69.9%、79.6%，其中大具和祿勸兩居群含量相對較高并且穩(wěn)定性較好。分布在鶴慶黃坪的居群，檢測出其揮發(fā)性主成分為乙酸龍腦酯（30.1%），但癸烯醛含量僅占4.5%，該結(jié)果與其他居群有明顯差異。通過對該物種不同居群植株葉片揮發(fā)性癸烯醛含量的分析，確定了質(zhì)量更好的種源，同時結(jié)合該植物所含馬兜鈴酸的情況，提出了健康安全的食用方式。該研究結(jié)果為合理開發(fā)貫葉馬兜鈴的經(jīng)濟(jì)價值及保護(hù)該瀕危物種提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論支持。

關(guān)鍵詞：貫葉馬兜鈴，揮發(fā)性成分，癸烯醛，固相微萃取，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

中圖分類號：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1251-08

Abstract：In order to study the variation of volatile components from dried leaves of different Aristolochia delavayi populations，solid-phase microextraction followed by gas chromatography coupled with mass spectrometry detection was used to analyze the chemical composition of these plants. The relative amount of each compound was determined by area normalization method. The results showed that the main volatile component of dry leaves was （E）-2-Decenal，which accounted for 63.5%，79.3%，69.9%，79.6% of the total volatile components，detected in the four populations of Shangri-La，Lijiang，Chuxiong，Luquan，respectively. However，the samples belonging to the Huangping population，Heqing County，showed a different volatile component pattern. The main volatile component from this population was bornyl acetate （30.1%） and （E）-2-Decenal only accounted for 4.5%，which was significantly lower than that of in the samples of the other four populations，and the possible reasons for the difference were analyzed and discussed. By analyzing the content of volatiles components in the leaves of A. delavayi，we identified the? excellent germplasm of A. delavayi. At the same time，the healthy and safe eating methods were put forward according to the situation of aristolochic acid contained in the plant. The study also provides technical guidance and theoretical support for rational use of this traditional medicinal plant species and protection this endangered species in China.

Key words：Aristolochia delavayi，volatile components，（E）-2-Decenal，solid-phase microextraction （SPME），gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

貫葉馬兜鈴（Aristolochia delavayi）是馬兜鈴科馬兜鈴屬多年生柔弱草本植物，因其葉基部心形而抱莖得名（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會，1988）（圖1）。又因其植株本身常揮發(fā)有類似姜科植物草果的濃郁辛香氣味，又名山草果（孫景梅等，2008;陳高等，2018）。該植物產(chǎn)于云南西北部及四川西南部的金沙江干熱和干暖河谷中，主要生長在1 640～2 250 m的石灰?guī)r山地、丘陵或河谷稀疏灌叢中，以及土層瘠薄、多礫石的黃壤地帶（金振洲等，1994;Yang et al.，2014;和文佳等，2017），是我國馬兜鈴科馬兜鈴屬的特有植物（Chen et al.，2015），同時也是一種擁有地域特色的野生食用香料資源（和文佳等，2010）。當(dāng)?shù)鼐用癯擞靡匀コＱ蛉怆兜南懔鲜秤猛?，還廣泛利用其葉作芳香健胃藥以增進(jìn)食欲或用于感冒、瘧疾等藥用（孫漢董等，1987）。由于當(dāng)?shù)鼐用窠?jīng)常用作香料使用，導(dǎo)致該物種的野外分布居群長期遭到采挖，再加上人類活動導(dǎo)致其生境的破碎化以及自然結(jié)實(shí)率低等自身生物學(xué)特性，致使其野生資源逐年減少，瀕臨滅絕。目前，貫葉馬兜鈴在《中國高等植物紅色名錄》和《世界自然保護(hù)聯(lián)盟（international union for conservation of nature，IUCN）紅色名錄》中均被列為野生瀕危物種（EN）（覃海寧等，2017）。

貫葉馬兜鈴特殊辛香氣味來源于其揮發(fā)油中的主成分反式-2-十一碳烯醛（孫漢董等，1987;周鐵生等，1995）。Li et al.（2013）

對其揮發(fā)油化學(xué)組分進(jìn)行了詳細(xì)的分析，結(jié)果在揮發(fā)油中共鑒定出95種組分，發(fā)現(xiàn)主成分為反式-2-癸烯醛并占總量一半以上;陳高等（2018）通過動態(tài)頂空吸附法結(jié)合GC-MS技術(shù)對貫葉馬兜鈴葉的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明反式-2-癸烯醛占分離出總揮發(fā)性成分的79.79%。因此，目前認(rèn)為癸烯醛可能是貫葉馬兜鈴精油的主成分。周鐵生等（1995）研究表明貫葉馬兜鈴精油中含有大量以反式-2-癸烯醛為主的2-烯脂肪醛類化合物，是傳統(tǒng)辛香料植物相關(guān)含量的5倍，因?yàn)?-烯脂肪醛類香料是高檔香精的增香劑，所以天然含有此化合物的貫葉馬兜鈴精油具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。貫葉馬兜鈴精油不僅在香料香精生產(chǎn)中具有很高的發(fā)揮潛力，而且該精油和其主成分癸烯醛對常見的細(xì)菌和真菌均還具有一定的抗菌活性，這或許是一種潛在抗菌性產(chǎn)品開發(fā)的來源（Li et al.，2013）。

在對其野外居群調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，由于貫葉馬兜鈴植株本身會在風(fēng)吹或有其他擾動的情況下散發(fā)出濃烈的辛辣氣味，這對我們在其生境中尋找為數(shù)不多的植株提供了幫助，同時發(fā)現(xiàn)不同地理區(qū)域植株所釋放的揮發(fā)性氣味略有不同。周鐵生和楊慶寬（1995）研究已表明該植物的精油主要存在于葉片中，鑒于揮發(fā)性氣味是揮發(fā)油的外在表現(xiàn)形式，且癸烯醛是貫葉馬兜鈴揮發(fā)油和葉揮發(fā)性氣味的主成分，從而以貫葉馬兜鈴葉的揮發(fā)性成分中癸烯醛含量來表示精油的“質(zhì)量”。因此，我們對不同地理區(qū)域的貫葉馬兜鈴葉揮發(fā)性氣味成分進(jìn)行分析，來探究貫葉馬兜鈴揮發(fā)性成分在不同居群間的特異性、穩(wěn)定性和一致性。

本研究按照對材料處理的傳統(tǒng)做法（陳佳齡等，2013;李美萍等，2019），采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對來自香格里拉三壩鄉(xiāng)、麗江大具、鶴慶黃坪、楚雄鐵鎖鄉(xiāng)和祿勸則黑鄉(xiāng)五個不同地理居群的貫葉馬兜鈴植物葉片揮發(fā)性成分進(jìn)行提取與分析，通過對不同居群植株葉揮發(fā)性成分穩(wěn)定性和差異性的比較，篩選出穩(wěn)定、高質(zhì)量貫葉馬兜鈴精油的種源，為以后的合理開發(fā)、種植，充分利用其經(jīng)濟(jì)價值，以及為改變當(dāng)?shù)鼐用竦膫鹘y(tǒng)食用方式和改善居民的健康狀況提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

自五個不同地理區(qū)域的新鮮貫葉馬兜鈴葉片，具體采集信息見表1。材料采集后在相同的條件下自然陰干。

1.2 方法

1.2.1 固相微萃?。ú杉瘬]發(fā)性成分） 分別稱取不同地理區(qū)域陰干的植物葉片3 g，剪碎后分別置于20 mL頂空萃取瓶里，每個萃取瓶中加入10 μL內(nèi)標(biāo)（二氯甲烷溶解的正壬烷720 ng），加磁性鐵蓋密封后進(jìn)行萃取。插入65 μm DVB/PDMS萃取頭于35 ℃頂空萃取45 min，于200 ℃汽化室解吸5 min。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程參考Chen et al.（2015）的方法進(jìn)行GC-MS分析。為確定揮發(fā)性成分的穩(wěn)定性，分別取同一居群的不同植株葉片各進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 GC-MS分析 采用美國Agilent Technologies公司生產(chǎn)的HP6890GC/5973MS型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）;柱溫起始為40 ℃，

保持5 min，程序升溫5 ℃·min-1，至280 ℃;柱流量為1.0 mL·min-1;進(jìn)樣溫度250 ℃;柱前壓100 kPa;進(jìn)樣量1.0 μL;分流比10∶1;載氣為高純氦氣。MS條件：電離方式EI，電子能量70 eV;傳輸線溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍35～500 amu。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Wiley7n.1譜庫檢索定性確認(rèn)貫葉馬兜鈴葉的揮發(fā)性化學(xué)成分，按照峰面積歸一化法計(jì)算出各化學(xué)成分的峰面積相對百分含量，并用正壬烷定量植物的自然釋放量，同時用在Sigma購買的標(biāo)準(zhǔn)品比對主成分反式-2-癸烯醛的真實(shí)性。

2 結(jié)果與分析

本研究從五個不同地理區(qū)域的貫葉馬兜鈴葉中共檢出46個化合物，詳情見表2。其中來自香格里拉三壩鄉(xiāng)居群植株葉片共鑒定出16個揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的97.86%。麗江大具鄉(xiāng)居群中共鑒定出26個揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的99.13%。楚雄鐵鎖鄉(xiāng)居群中共鑒定出22個揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的98.58%。祿勸則黑鄉(xiāng)居群中共鑒定出24個揮發(fā)性成分，占總揮發(fā)性成分的97.93%。在來自鶴慶黃坪居群植株葉片中共分離出30個揮發(fā)性成分，占揮發(fā)性成分總量的94.56%，然而其主要揮發(fā)性成分及其含量與前四個居群差異明顯，具體見表3。由此可見，除了來自黃坪地區(qū)的居群外，其他四個地區(qū)來源的貫葉馬兜鈴葉主要揮發(fā)性成分均為反式-2-癸烯醛，且分別占揮發(fā)性成分檢出總量的63.47%、79.31%、69.91%、79.57%，這與之前研究的結(jié)果相似（Li et al.，2013;陳高等，2018）。另外，通過對萃取過程中加入的內(nèi)標(biāo)（正壬烷）換算得出，上述五個居群中每個居群植株干葉片平均每克每小時釋放癸烯醛的量分別為17.31、21.63、19.06、21.70、1.22 ng。從以上結(jié)果可以看出，來自大具和祿勸兩居群的植株葉揮發(fā)性成分中癸烯醛占有較高含量以及相對較高的釋放量，且在居群內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

3 討論與討論

貫葉馬兜鈴被用作香料食用主要是在金沙江兩岸的三壩和大具兩地區(qū)。這兩個地區(qū)居群規(guī)模較大且分布集中，有著長期被廣泛利用的基礎(chǔ)，因此也成為當(dāng)?shù)丶{西族人重要的傳統(tǒng)香料。然而以貫葉馬兜鈴干植株或葉片直接用作香料的傳統(tǒng)方式存在潛在的健康隱患。當(dāng)前，關(guān)于馬兜鈴酸類物質(zhì)（AAs）導(dǎo)致的腎衰竭、尿毒癥、肝毒性等問題已進(jìn)行過大量報(bào)道（Vanherweghem et al.，1993;Nortier et al.，2000;Debelle et al.，2008;Ng et al.，2017）。陳高等（2018）為弄清楚當(dāng)?shù)鼐用袷秤玫呢炄~馬兜鈴中馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ的含量組成情況，分別對貫葉馬兜鈴干燥葉、果、根中馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ的含量進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸Ⅰ在各部分的含量分別為5.5、456.5、1 680.4 μg·g-1，其中果和根中馬兜鈴酸Ⅰ的含量均遠(yuǎn)超《中國藥典》（2010版）規(guī)定的最高上限（10 μg·g-1）。雖然干燥葉中馬兜鈴酸Ⅰ的含量低于規(guī)定的上限值，但鑒于馬兜鈴酸及其衍生物的致突變性（Grollman，2013;Stiborova et al.，2017），建議盡量不要直接用作香料食用。由于馬兜鈴酸類物質(zhì)不具有揮發(fā)性（姚東云等，2007），因此貫葉馬兜鈴的揮發(fā)油中不會含此類物質(zhì)，并且香料成分也主要存在于揮發(fā)油中，所以對其揮發(fā)油成分的開發(fā)應(yīng)用，可以為當(dāng)?shù)鼐用袷褂脗鹘y(tǒng)香料提供一個更安全的食用方式。

關(guān)于貫葉馬兜鈴精油的提取分析早就有過一些研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精油的主成分以及含量情況分別為反式-2-十一碳烯醛（94.23%）、反式-2-十一碳烯醛（53.24%）、反式-2-癸烯醛（52.00%）（孫漢董等，1987;周鐵生等，1995;Li et al.，2013）。以上研究均采用水蒸餾法提取，但精油成分的組成卻有較大差異，可能是由于蒸餾處理通常會導(dǎo)致植物的組織細(xì)胞及代謝相關(guān)的酶產(chǎn)生變化，且操作和控制條件的不同，提取的精油成分含量可能會出現(xiàn)較大變化;也可能與不同研究者材料的來源、采集季節(jié)，材料的處理方式不同以及揮發(fā)性成分鑒定錯誤有關(guān)。本研究沒有采取水蒸餾法提取植物葉片揮發(fā)性成分，而是依照陳高等（2018）的方法，對其葉片氣味成分進(jìn)行收集分析，因?yàn)檫@樣才符合當(dāng)?shù)厝说氖褂昧?xí)慣;以及在此研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了揮發(fā)性成分在居群內(nèi)和居群間的穩(wěn)定性和差異性。同時，為避免材料采集季節(jié)、干燥方法的不同對結(jié)果產(chǎn)生影響，我們采取時間上同季，干燥方法相同的策略，以此來最大限度地消除方法上的誤差。

貫葉馬兜鈴精油不僅具有廣譜的抗菌活性，而且含有豐富的合成香精香料的重要組分不飽和脂肪醛（張華，2006;江明等，2013;Li et al.，2013）。另外，在我們調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鼐用駜Υ娑嗄甑母稍锶~中辛香氣味還是非常的濃烈，這可能與特殊香料的抗氧化作用有關(guān)（王愛云和李春華，2002），因而我們認(rèn)為貫葉馬兜鈴精油具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，選擇合適的種源進(jìn)行規(guī)模化種植，以及優(yōu)化提取精油工藝，充分開發(fā)利用貫葉馬兜鈴精油，不僅為抗菌類產(chǎn)品的開發(fā)提供新的借鑒，也將對香精香料的合成提供原料來源。

此外，我們發(fā)現(xiàn)來自黃坪的居群與其他居群在植株葉揮發(fā)性氣味及成分上存在較大差異。在樣品采集前，鑒于該居群植株葉片氣味的特異性，依據(jù)貫葉馬兜鈴一般的識別特征，對其植株葉片的形態(tài)以及葉的著生方式進(jìn)行了觀察，初步確認(rèn)是貫葉馬兜鈴的居群。該居群植株葉片散發(fā)出類似塑料的氣味，這與本種植物通常所含的辛香氣味相去甚遠(yuǎn)。根據(jù)以前的研究，塑料的揮發(fā)性成分中主要是羰基類化合物，產(chǎn)生塑料氣味的是低分子的己酮和甲基戊烯酮（Villberg et al.，1997;羅忠富等，2010;孔萍和林新花，2011），然而在本研究中沒有檢測出類似氣味的成分，我們推測這種氣味的來源可能是揮發(fā)性成分混合而引起的“雞尾酒效應(yīng)”（Thomsen et al.，2018）。另外，與其他居群典型的干熱河谷生境相比，該居群分布在黃坪境內(nèi)遠(yuǎn)離金沙江支流的某山體上部區(qū)域中，由于相對海拔較高，該分布區(qū)小氣候呈現(xiàn)濕熱的特點(diǎn)，生境中草本的覆蓋度較高且立地條件屬于石灰?guī)r地質(zhì)不同于干熱河谷的松散沙石土質(zhì)。揮發(fā)性氣味成分的較大差異以及特異的生境分布（該居群異于其他四個居群沿江或其支流分布的特點(diǎn)，存在一定程度地理隔離）是否暗示該居群為另一變種或亞種的可能（Francisco et al.，2008），還需對其花部結(jié)構(gòu)等特征進(jìn)行比較并結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)一步確定。

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