摘要 介紹了利用木瓜蛋白酶酶解分離蛋殼殼膜的方法，探討了木瓜蛋白酶酶解分離殼膜的最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶酶解分離殼膜的最佳反應(yīng)條件如下：蛋殼粉用量為50 g，木瓜蛋白酶用量占蛋殼粉量的2.5‰，反應(yīng)時(shí)間為90 min，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)體系pH為5.5，反應(yīng)體系固液比為1∶8。在此最佳反應(yīng)條件下，回收殼下膜的平均重量為1.65 g。

關(guān)鍵詞 木瓜蛋白酶;分離;殼膜

中圖分類(lèi)號(hào) TS253.9 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A ?文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0186-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.049

Abstract This paper introduced the method of separating shell membrane by enzymatic hydrolysis of papain. The optimal reaction conditions for the separation of shell membrane by enzymatic hydrolysis of papain were as follows： eggshell powder dosage of 50 g， the proportion of papain dosage in eggshell powder dosage of 2.5‰， the reaction time of 90 min， the reaction temperature of 60 ℃， pH of the reaction system of 5.5， solidliquid ratio of 1∶8. Under the optimal reaction conditions， the average weight of the undershell membrane recovered 1.65 g.

Key words Papain;Separation;Eggshell membrane

基金項(xiàng)目 衡陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2015KS26）;湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院支柱工程資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 李逢振（1983—），男，湖南衡陽(yáng)人，副教授，碩士，從事畜產(chǎn)品加工和畜禽廢棄物綜合利用研究。

收稿日期 2020-03-25

隨著人們生活水平的不斷提高，雞蛋已成為居民餐桌上必不可少的動(dòng)物性食品。蛋殼是雞蛋的重要組成部分，其主要由石灰質(zhì)真殼和殼下膜2個(gè)部分組成[1]，石灰質(zhì)真殼中的碳酸鈣可以用于轉(zhuǎn)化制備乳酸鈣[1]、乙酸鈣[2]等生物有機(jī)鈣產(chǎn)品。從殼下膜中可以轉(zhuǎn)化提取出抗氧化多肽[3]、透明質(zhì)酸[4]、硫酸軟骨素[5]等可溶性高分子化合物，這些物質(zhì)可用于制備生物吸附劑[6]、酶生物傳感器固定化膜[7]、生物礦化調(diào)控基質(zhì)[8]、新型藥物控釋材料及醫(yī)用包扎材料[9]、膠原蛋白護(hù)膚品[10]等產(chǎn)品，具有極高的利用價(jià)值。筆者選用木瓜蛋白酶對(duì)蛋殼進(jìn)行生物酶解，使其殼膜分離，旨在為進(jìn)一步研究利用石灰質(zhì)真殼和殼下膜奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞蛋購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng);木瓜蛋白酶（食品級(jí)酶制劑，酶活200 000 U/g，南寧龐博）;鹽酸（分析純，國(guó)藥試劑）;氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥試劑）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電熱恒溫干燥箱（型號(hào)202，上?？坪悖?數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號(hào)HHS，上海博迅）;粉碎機(jī)（型號(hào)QE-200，武義屹立）;電子分析天平（型號(hào)JJ224BC，常熟雙杰）;數(shù)顯酸度計(jì)（型號(hào)PHS-3C，上海越平）。

1.3 試驗(yàn)原理

雞蛋的石灰質(zhì)真殼部分與殼下膜主要通過(guò)糖蛋白微細(xì)纖維相連接，其主要是由蛋白質(zhì)組成，因此可以使用木瓜蛋白酶在適當(dāng)條件下對(duì)其進(jìn)行生物酶解，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成多肽和氨基酸等物質(zhì)，改變真殼乳頭層中的鈣纖維狀錐形體與殼下膜中角蛋白的結(jié)合狀態(tài)，降低石灰質(zhì)真殼與殼下膜的結(jié)合力[11]，從而達(dá)到分離殼膜的目的。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 雞蛋殼預(yù)處理階段。

將去除蛋黃和蛋清等可食部分的雞蛋殼置于清水中浸泡30 min，再用清水沖洗，去除雞蛋殼表面附著的雜質(zhì)，洗凈后撈出。將瀝干水分的雞蛋殼放入70 ℃恒溫干燥箱中干燥3 h，待蛋殼冷卻后用粉碎機(jī)粉碎3 min，貯藏備用。

1.4.2 酶解反應(yīng)階段。

取50 g蛋殼粉置于燒杯中，將調(diào)節(jié)好pH的純凈水按一定比例加入燒杯中，再加入木瓜蛋白酶攪拌5 min，將攪拌好的燒杯置于恒溫水浴鍋中，進(jìn)行酶解反應(yīng)。

1.4.3 干燥稱(chēng)量階段。

待酶解反應(yīng)完成后，去除上清液，再將燒杯置于電熱恒溫干燥箱中進(jìn)行干燥，干燥完成后將上層蛋膜取出進(jìn)行稱(chēng)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶用量對(duì)回收殼下膜的影響

稱(chēng)取50 g蛋殼粉置于燒杯中，備用;將pH 5.5的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入不同用量的木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)120 min。稱(chēng)量不同木瓜蛋白酶用量下酶解反應(yīng)后回收的殼下膜重量，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，回收的殼下膜量逐漸增加，當(dāng)酶用量達(dá)到2.5‰時(shí)回收的殼下膜量最多，隨后當(dāng)酶用量繼續(xù)增加時(shí)，回收的殼下膜量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這是由于過(guò)量的酶與殼下膜在反應(yīng)體系中繼續(xù)發(fā)生酶解反應(yīng)，從而導(dǎo)致回收的殼下膜量減少。由此可見(jiàn)，當(dāng)木瓜蛋白酶用量為蛋殼粉量的2.5‰時(shí)，可以取得較好的殼膜分離效果。

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)回收殼下膜的影響

稱(chēng)取50 g蛋殼粉置于燒杯中，備用;將pH 5.5的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)不同時(shí)間。稱(chēng)量不同反應(yīng)時(shí)間的酶解反應(yīng)后回收的殼下膜重量，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，回收的殼下膜量呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為90 min時(shí)回收的殼下膜量最多，此后隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)增加時(shí)，木瓜蛋白酶與殼下膜繼續(xù)發(fā)生酶解反應(yīng)，導(dǎo)致殼下膜逐漸損耗。同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致反應(yīng)消耗的能源逐漸增加。由此可見(jiàn)，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應(yīng)90 min時(shí)可以取得較好的殼膜分離效果。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)回收殼下膜的影響

稱(chēng)取50 g蛋殼粉置于燒杯中備用，將pH 5.5的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后，再將燒杯放入不同溫度的恒溫水浴鍋中反應(yīng)90 min。稱(chēng)量不同反應(yīng)溫度條件下酶解反應(yīng)后回收的殼下膜重量，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度為45～60 ℃時(shí)，回收的殼下膜量逐漸增加，但總體變化不大，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)60 ℃后，回收的殼下膜量出現(xiàn)明顯的下降。這是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致木瓜蛋白酶發(fā)生變性，使得木瓜蛋白酶的酶活力明顯減弱，從而影響了酶解反應(yīng)的殼膜分離效果。由此可見(jiàn)，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應(yīng)溫度保持在60 ℃時(shí)可以取得較好的殼膜分離效果。

2.4 反應(yīng)體系pH對(duì)回收殼下膜的影響

稱(chēng)取50 g蛋殼粉置于燒杯中備用，將不同pH的純凈水按1∶8的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)90 min。稱(chēng)量不同反應(yīng)體系pH條件下酶解反應(yīng)后回收的殼下膜重量，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，木瓜蛋白酶在偏酸性和中性的環(huán)境中均能發(fā)揮較好的酶解效果，當(dāng)反應(yīng)體系pH為4.5～5.5時(shí)回收的殼下膜量最多，隨著反應(yīng)體系的pH升高，回收的殼下膜量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)榉磻?yīng)體系的pH逐漸向木瓜蛋白酶的等電點(diǎn)8.75靠近，酶活性受到抑制，影響了殼膜分離效果。另外，反應(yīng)體系的pH越低，反應(yīng)產(chǎn)生的廢液對(duì)環(huán)境造成污染會(huì)更加嚴(yán)重，因此需要在試驗(yàn)結(jié)果確定時(shí)進(jìn)行綜合考量。由此可見(jiàn)，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應(yīng)體系的pH控制在5.5時(shí)可以取得較好的殼膜分離效果。

2.5 反應(yīng)體系固液比對(duì)回收殼下膜的影響

稱(chēng)取50 g蛋殼粉置于燒杯中備用，將pH 5.5的純凈水按不同的固液比加入燒杯中，加入2.5‰木瓜蛋白酶后再將燒杯放入60 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)90 min。稱(chēng)量不同固液比下酶解反應(yīng)后回收的殼下膜重量，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，隨著反應(yīng)體系固液比的增加，回收的殼下膜量總體上呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，說(shuō)明在液體環(huán)境下木瓜蛋白酶的活力得到有效激發(fā)，酶解反應(yīng)順利進(jìn)行。但是，當(dāng)固液比達(dá)到1∶9時(shí)，回收的殼下膜量稍微有所減少，這是由于大量液體稀釋了木瓜蛋白酶的酶解效果。由此可見(jiàn)，木瓜蛋白酶與蛋殼粉酶解反應(yīng)體系的固液比為1∶8時(shí)可以取得較好的殼膜分離效果。

2.6 最佳反應(yīng)條件的確定

通過(guò)以上單因素試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)條件如下：蛋殼粉用量為50 g;木瓜蛋白酶用量占蛋殼粉量的2.5‰;反應(yīng)時(shí)間為90 min;反應(yīng)溫度為60 ℃;反應(yīng)體系pH為5.5;反應(yīng)體系固液比為1∶8。選用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，確定最佳反應(yīng)條件下回收的殼下膜重量，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在最佳反應(yīng)條件下，采用木瓜蛋白酶進(jìn)性殼膜分離能取得較好的效果，在蛋殼粉用量為50 g、木瓜蛋白酶用量為蛋殼粉量的2.5‰、反應(yīng)時(shí)間為90 min、反應(yīng)溫度為60 ℃、反應(yīng)體系pH為5.5、反應(yīng)體系固液比為1∶8的條件下回收殼下膜的平均重量為1.65 g。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，利用木瓜蛋白酶的酶解作用可使蛋殼真殼與殼下膜發(fā)生分離，其最佳反應(yīng)條件如下：蛋殼粉用量為50 g;木瓜蛋白酶用量占蛋殼粉量的2.5‰;反應(yīng)時(shí)間為90 min;反應(yīng)溫度為60 ℃;反應(yīng)體系pH為5.5;反應(yīng)體系固液比為1∶8。在此條件下回收殼下膜的平均重量為1.65 g。經(jīng)過(guò)殼膜分離可以獲取更加純凈的蛋殼真殼和殼下膜，為其后續(xù)的轉(zhuǎn)化利用奠定了基礎(chǔ)。

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