王 萍，李鐵剛

0 引言

百草枯(PQ)是一種雜環(huán)類有機速效除草劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，對人類和動物都有劇毒，致死率高達(dá)70%[1]。在全球范圍內(nèi)，每年有250 000～370 000人死于農(nóng)藥中毒[2]，其中，因PQ中毒導(dǎo)致的死亡已經(jīng)成為中毒患者的主要死因。這也成為一些國家尤其是發(fā)展中國家面臨的一個重要公共衛(wèi)生問題[3-5]。臨床研究顯示，中毒患者肺部PQ濃度是血漿中濃度的6～10倍[6]，早期可表現(xiàn)為急性肺損傷及不同程度的急性呼吸窘迫綜合征，肺泡細(xì)胞受損嚴(yán)重[7-8]，肺組織過度修復(fù)。百草枯通過中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白到肺部[9]，繼而發(fā)生不可逆性和廣泛性的肺纖維化，最終導(dǎo)致較高的死亡率[10]。目前，尚無有效的藥物可以預(yù)防和治療纖維化的進(jìn)展[11]，需要更多的臨床和實驗來探究中毒的機制。因此，本研究采用腹腔注射方式建立小鼠PQ中毒致肺纖維化模型，通過動物模型多方面評估其纖維化的表現(xiàn)，確定最佳的造模濃度，建立穩(wěn)定的動物模型，為以后纖維化的機制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 無特定病原體級別(SPF)的BALB/c小鼠(6～8周齡，雄性，18～22 g) 40只，由中國醫(yī)科大學(xué)本溪研發(fā)中心實驗動物部提供。在控制溫度為22.2 ℃的室內(nèi)，將小鼠圈養(yǎng)在恒定的12 h光照/12 h黑暗循環(huán)環(huán)境中。這些實驗經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(許可編號：2017PSPSK)。百草枯粉劑購自美國Sigma公司，抗α-SMA抗體和E-cadherin抗體購自Abcam公司(批號：ab5694、ab76055)。

1.2 動物分組和處理方法 PQ中毒的小鼠模型建立。腹腔注射方式染毒，方法：A組為生理鹽水空白對照組；B組10 mg/kg單次染毒；C組20 mg/kg單次染毒；D組10 mg/kg隔日1次染毒。共3次。D組首次染毒后至第21天，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死小鼠，取雙肺組織。

1.3 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin，HE染色)、馬松(Masson染色)染色 將小鼠整個左肺組織用4%福爾馬林固定過夜。在70%乙醇中常規(guī)脫水，并在二甲苯中澄清，制備4 μm切片用于常規(guī)梯度酒精脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色鏡下評估肺組織病理學(xué)變化和Masson染色，用于證明膠原沉積。

1.4 Ashcroft評分 用Ashcroft半定量評分來評估小鼠肺組織纖維化程度[12]。具體評分標(biāo)準(zhǔn)：0級，正常組織；1級，支氣管壁輕度增厚；2～3級，纖維化程度加重，支氣管肺泡壁中度增厚；4～5級，重度纖維化改變，支氣管壁結(jié)構(gòu)破壞，有纖維條索或纖維團(tuán)塊形成；6～7級，極重度纖維化，大范圍肺組織結(jié)構(gòu)破壞，可伴有蜂窩肺形成；8級，滿布纖維組織，整個肺組織全部閉塞壞死。

1.5 Western blot蛋白檢測 取小鼠右肺組織剪碎成小塊稱重，放入EP管中。用提前預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的蛋白質(zhì)抽提試劑在冰上裂解肺組織后于14 000 g離心，取上清液轉(zhuǎn)移入新的EP管中。用BCA法測定提取的上機檢測蛋白濃度。取50 g總蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗孵育4 ℃過夜。辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育l h，上機掃描檢測拍照。每組實驗至少重復(fù)3次。

1.6 觀察指標(biāo) 一般情況檢測：小鼠精神狀態(tài)、體重、毛發(fā)、呼吸頻率、進(jìn)食水量及異常行為(激惹)和小鼠的生存分析，肺組織HE染色，Masson三色染色，α-SMA和E-cadherin蛋白檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。采用Kaplan-Meier生存分析，采用雙側(cè)非配對t檢驗，與正常對照組進(jìn)行比較。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 A組(生理鹽水對照組)小鼠精神狀態(tài)佳，毛發(fā)光潔，鼠尾無發(fā)紺，進(jìn)食水等正常，體重穩(wěn)定增加；B組(10 mg/kg，單次染毒組)小鼠精神狀態(tài)略可，活動略下降，呼吸無急促，體重增加緩慢，進(jìn)食水正常，4～5 d后基本恢復(fù)正常狀態(tài)；C組(20 mg/kg，單次染毒組)小鼠精神萎靡，體重持續(xù)下降，活動減少，易抓捕，走路不穩(wěn)，口周發(fā)紺，部分小鼠于5 d后出現(xiàn)死亡；D組(10 mg/kg，隔日1次染毒組，共3次)小鼠精神狀態(tài)極差，體重下降明顯，腹瀉，口周鼠尾發(fā)紺，甚至出血潰爛，毛發(fā)蓬松暗淡，頭顫，前期喘息氣促，點頭樣呼吸，個別小鼠伴隨有激惹現(xiàn)象，后期呼吸頻率下降，精神萎靡，無進(jìn)食水，7 d全部死亡。

2.2 生存分析 A組和B組21 d全部存活；C組于第7天死亡率達(dá)70%，7 d后較平穩(wěn)；D組第11天后全部死亡。重復(fù)實驗后，C組動物模型最為穩(wěn)定。見圖1。

圖1 小鼠的生存分析圖

2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 A組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤，有少量出血點。B組和C組肺泡間隔增厚，淋巴細(xì)胞浸潤，肌成纖維細(xì)胞增多，膠原纖維形成。D組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂破壞嚴(yán)重，萎縮塌陷至消失，大量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 小鼠肺組織HE染色(100×)

2.4 Masson染色 A組可見結(jié)構(gòu)大致正常，僅大血管周圍可見少許藍(lán)色膠原纖維。B組可見不同程度的肺泡間隔增寬，有增生的肌纖維和膠原纖維。C組肺泡結(jié)構(gòu)明顯增寬，膠原纖維組織沉積較多。D組肺泡間隔及肺泡腔大面積被破壞、閉塞。組織被大量的藍(lán)色膠原纖維填充。見圖3。

圖3 小鼠肺組織的Masson染色(100×)

2.5 小鼠肺組織的Ashcroft評分 PQ染毒濃度越大，小鼠肺組織損傷越重，Ashcroft評分越高。D組(10 mg/kg，隔日1次染毒組，共3次)評分最高，肺組織損傷最為嚴(yán)重，小鼠全部死亡。根據(jù)評分和動物臨床表現(xiàn)綜合，C組(20 mg/kg，單次染毒組)模型最佳。見表1。

表1 小鼠肺組織的Ashcroft評分

2.6 Western blot檢測 A組小鼠無中毒，其肺組織無纖維化改變，其間質(zhì)表達(dá)α-SMA最少。B組、C組與A組空白對照組比較，其上皮標(biāo)記E-cadherin依次減少，而間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA逐漸增加，以20 mg/kg單次給藥組為最佳。D組隔日1次染毒，共3次，給藥劑量較大。見圖4。

圖4 Western blot檢測結(jié)果

3 討論

百草枯是發(fā)展中國家廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的除草劑，其中毒發(fā)病率和自殺使用率呈逐年上升趨勢[13]，且具有救治率低、死亡率高的特征，目前臨床尚無有效救治藥物?；颊呒词苟冗^急性期，也會逐漸進(jìn)展為不可逆性肺部纖維化，直至呼吸困難最終死亡[14]。近年來，關(guān)于肺部纖維化疾病的研究較多，探索纖維化相關(guān)的分子和信號通路一直是熱門方向，但是發(fā)病機制一直不明確。在建立動物纖維化模型方面，研究者也采用了多種方式：有通過大鼠吸入二氧化硅建模，也有通過小鼠博來霉素滴鼻誘導(dǎo)[15-16]。盡管動物博來霉素誘導(dǎo)和百草枯致肺纖維化在表型上相似，但實際是不同的。百草枯處理過的肺部表現(xiàn)出明顯的促成纖維細(xì)胞破壞，肺泡內(nèi)纖維化和閉塞性纖維化；相比之下，博來霉素治療首先誘導(dǎo)細(xì)胞脫落和肺泡崩解，然后隨著肺泡壁的纖維增厚而發(fā)展為間質(zhì)纖維化[17-18]。此外，有關(guān)百草枯誘導(dǎo)的纖維化模型較少，主要是大部分患者以急性肺損傷為主，死亡率較高，幸存者較少，且留有肺纖維化的后遺癥，嚴(yán)重影響肺功能[19]。PQ中毒導(dǎo)致的非纖維化有進(jìn)展快且不可逆的特點，因此，模擬患者中毒，構(gòu)建穩(wěn)定的纖維化模型是研究PQ中毒后纖維化機制的重要前提，進(jìn)而才能尋找有效的治療方法。

本研究通過不同劑量PQ對小鼠進(jìn)行腹腔注射，從單次染毒到隔日1次染毒多種方式尋找穩(wěn)定的建模染毒濃度。研究發(fā)現(xiàn)，注射不同劑量的百草枯，小鼠出現(xiàn)不同程度中毒反應(yīng)。10 mg/kg單次染毒組小鼠無死亡，雖然有不同程度的肺部纖維化特征，但癥狀較輕。相比之下，百草枯濃度為20 mg/kg時，21 d后動物纖維化模型更為穩(wěn)定，出現(xiàn)部分死亡，不會造成過多的數(shù)據(jù)丟失，同時21 d后存活的小鼠肺部組織產(chǎn)生晚期慢性炎癥反應(yīng)與穩(wěn)定的纖維化特征，符合人中毒后慢性行為特征和死亡率[20]。進(jìn)一步的肺組織病理學(xué)檢查也證實，動物模型的肺泡結(jié)構(gòu)破壞、消失，肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增厚，淋巴細(xì)胞浸潤，Masson染色判斷肌成纖維細(xì)胞增多，膠原纖維形成，表明纖維化模型是穩(wěn)定可靠的。Ashcroft評分一直是較經(jīng)典的纖維化評分，在病理專家協(xié)助下，在HE染色的基礎(chǔ)上進(jìn)行半定量評分，操作簡易、客觀、真實[21-22]。在建模穩(wěn)定基礎(chǔ)上，取小鼠的肺組織進(jìn)一步驗證上皮標(biāo)記物E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)存活小鼠肺組織纖維化越嚴(yán)重，間質(zhì)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)越高，上皮標(biāo)志物E-cadherin越低。D組隔日1次給藥方式，由于劑量過大，小鼠在實驗初期可能就死于急性肺損傷，肺部纖維化還沒能形成，不適合纖維化模型的構(gòu)建。因此，本研究通過動物重復(fù)試驗，采用20 mg/kg單次腹腔注射方式染毒，觀察21 d制備的方法，多方面來評估纖維化的最佳模型，為下一步纖維化進(jìn)展機制和治療打下基礎(chǔ)。