趙亞珠，郝曉秀，孟婕，高翔

1(天津職業(yè)大學(xué) 包裝與印刷工程學(xué)院，天津，300410)2(宏觀世紀(jì)(天津)科技股份有限公司，天津，301700)

果蔬極易滋生霉菌而腐爛，使用防腐劑成為緩解其腐爛最常見的措施?？紤]到防腐劑對人體的危害性，一些食藥同源的植物源抑菌劑近年來成為研究熱點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)對食源性致病菌具有強(qiáng)抑制作用的植物精油主要有百里香、丁香、牛至、肉桂、大蒜等[1]，其中牛至精油是最有效的天然抑菌劑之一[2]。

牛至為唇形科植物，廣泛分布在我國及希臘、土耳其、墨西哥等地[3-4]。MUNHUWEYI等[5]測試了幾種植物精油對灰葡萄孢和青霉的抑制作用，抑菌效果依次為牛至>肉桂>檸檬草；ROYO等[6]利用牛至精油制備的抗菌濾紙對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有抑菌作用；AGRIMONTI等[7]發(fā)現(xiàn)添加牛至精油的纖維素墊對碎牛肉的嗜冷菌群具有抑菌作用；王建清等[8]制備的牛至精油涂布紙板對青霉菌等具有明顯抑制作用。LEE等[9]用羥丙基甲基纖維素與牛至精油納米乳液制備成復(fù)合膜對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌均有強(qiáng)抑制作用。

牛至精油抑菌效果已有報(bào)道，但是關(guān)于牛至精油的活性成分未見相關(guān)深入的研究，光照、pH值等是否會影響其穩(wěn)定性亦未見研究，牛至精油抗菌涂層中活性成分的釋放特性也值得探索。本實(shí)驗(yàn)通過對牛至精油活性成分進(jìn)行處理，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)分析和抑菌實(shí)驗(yàn)確定牛至精油的抑菌活性成分，研究其在光照、溫度、濕度、pH值條件下的穩(wěn)定性。由于瓦楞紙箱是一種常見的果蔬保鮮包裝[10]，將活性成分涂布于紙箱內(nèi)壁可以緩解果蔬在貯藏和運(yùn)輸過程中的腐爛，本實(shí)驗(yàn)以抗菌瓦楞紙箱為例研究抑菌活性成分的釋放特性。論文研究成果可為植物源酚類抑菌劑在果蔬防腐保鮮中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香芹酚標(biāo)品(色譜純)，上海融禾醫(yī)藥科技公司；牛至精油，長沙格綠生物科技公司；交鏈孢霉、青霉、腐霉、灰霉，天津科技大學(xué)食品學(xué)院提供；正己烷(光譜純)，天津市江天化工技術(shù)公司。

Varian 4000MS GC-MS色譜儀，美國瓦里安公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)，GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司。

1.2 牛至精油抑菌效果測試

參考王建清等[11]的方法測試牛至精油對4種霉菌的抑菌效果。濾紙片(直徑6 mm)，玻璃培養(yǎng)皿(直徑90 mm)、玻璃涂抹棒、鑷子等160 ℃滅菌2 h密封保存?zhèn)溆?。吸取活化后的菌懸?00 μL(濃度約1×107CFU/mL)加到PDA培養(yǎng)基表面，涂抹均勻，放置濾紙片，吸取10 μL牛至精油至濾紙片上，每種菌做3個(gè)平行皿。28 ℃培養(yǎng)48 h后測試抑菌圈直徑，連續(xù)測試8 d。

1.3 牛至桂精油成分鑒定

參考王建清等[11]的方法使用GC-MS鑒定牛至精油的成分。氣相色譜主要參數(shù)： VF-5 ms色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度300 ℃；分流比10∶1；色譜柱初始溫度60 ℃(保持3 min)，5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃， 300 ℃保持5 min。質(zhì)譜主要參數(shù)：EI離子源，阱溫220 ℃，50～1 000 m/z全掃描。用正己烷將牛至精油稀釋10 000倍，取1 μL進(jìn)樣。由于有文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道牛至精油主要成分為香芹酚或百里香酚，為進(jìn)一步確認(rèn)其主要成分，將香芹酚標(biāo)品和百里香酚標(biāo)品稀釋10 000倍后各取1 μL進(jìn)行氣相色譜(gas chromatography，GC)進(jìn)樣分析。通過檢索質(zhì)譜庫，比對香芹酚標(biāo)品、百里香酚標(biāo)品出峰時(shí)間，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]確認(rèn)精油各成分，用峰面積占總出峰面積的百分比表示各成分相對含量。

1.4 牛至精油抑菌活性成分確定

1.4.1 香芹酚和牛至精油抑菌效果對比測試

用正己烷將香芹酚和牛至精油稀釋10倍，參照1.2 的方法測定其對灰霉的抑菌圈直徑。

1.4.2 牛至精油活性成分處理及GC分析

將1 mL牛至精油與200 mL 0.1 mol/L NaOH溶液充分反應(yīng)，用適量的正己烷重復(fù)萃取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)正己烷。用正己烷(色譜純)將NaOH溶液處理后的牛至精油和香芹酚標(biāo)品稀釋10 000倍，各取1 μl進(jìn)行GC分析。GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器FID，柱子型號DB-17 (30 m×0.25 μm×0.25 mm)，分流比10，載氣N2，柱子初始溫度80 ℃，以5 ℃/min升溫至最250 ℃，在250 ℃保持5 min。

1.4.3 NaOH溶液處理后的牛至精油抑菌試驗(yàn)

將牛至精油按1.4.2方法處理后進(jìn)行灰霉抑菌效果測試(方法同1.2)。

1.5 牛至精油活性成分穩(wěn)定性分析

參考劉萬臣[14]的方法分析牛至精油活性成分香芹酚的穩(wěn)定性。采用無水乙醇將香芹酚標(biāo)品分別稀釋為3×10-5、3×10-4、3×10-3g/mL，使用紫外-可見分光光度計(jì)在200～1 100 nm進(jìn)行掃描，測定最大吸收波長及其對應(yīng)的吸光度值。分析光照時(shí)間、溫度、不同濕度、不同pH值對香芹酚吸光度值的影響。由于精油揮發(fā)性較強(qiáng)，采用精油制備抗菌活性材料時(shí)一般盡可能避免高溫以免造成其揮發(fā)損失，很多研究[8,15-16]制備牛至精油活性材料的溫度≤60 ℃，所以本實(shí)驗(yàn)研究牛至精油在60 ℃處理時(shí)的穩(wěn)定性。以質(zhì)量濃度為3×10-5g/mL香芹酚為研究對象，分別在如下條件測試其特征波長下的吸光度值：(1)將其在自然光下處理0～8 h，1 h測試1次；(2)將其在60 ℃水浴處理0～8 h，1 h測試1次；(3)將其置于20%、50%、90%濕度條件下放置8 d，1 d測試1次。(4)將其用HCl和NaOH溶液調(diào)成pH為2～13，測試不同pH值對吸光度值的影響。

1.6 抗菌瓦楞紙箱的制備

將 8 g β-環(huán)糊精60 ℃溶解于200 mL蒸餾水，加入牛至精油(使其質(zhì)量濃度為5、10、20、30 g/L)，添加2 mL吐溫-80，超聲處理80 min，加入10 g殼聚糖，攪拌30 min，靜置12 h備用。將牛至精油乳液涂布于A楞紙箱內(nèi)壁(24 cm×20 cm×5.5 cm)制得抗菌紙箱，記為T1、T2、T3和T4(對應(yīng)精油質(zhì)量濃度分別為5、10、20、30 g/L)，乳液涂布量為(160±5) g/m2，自然風(fēng)干。紙箱頂部加工一個(gè)直徑10 mm的圓孔，粘貼硅膠板密封，空白紙箱記為CK。

1.7 抗菌紙箱內(nèi)香芹酚釋放測試

用氣體進(jìn)樣針經(jīng)硅膠片從紙箱內(nèi)吸取10 μL氣體，立即GC進(jìn)樣，分析條件同1.4.2，每天測試1次，連續(xù)測試5 d。將0.5 mL牛至精油置于500 mL空白試劑瓶中，自然放置12 h，使其香芹酚達(dá)到氣體平衡。取試劑瓶中的氣體10 μL進(jìn)行GC分析，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中:Ai為各組紙箱氣體在GC中的香芹酚峰面積；A0為試劑瓶中氣體在GC中香芹酚峰面積；A為各抗菌紙箱內(nèi)香芹酚的相對百分含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05時(shí)存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至精油對4種霉菌的抑菌效果

牛至精油對4種霉菌的抑菌圈直徑見表1。牛至精油對青霉和灰霉的抑菌圈直徑在10 d以內(nèi)一直為90 mm，這說明牛至精油對灰霉和青霉有很強(qiáng)的殺滅作用。牛至精油對交鏈孢霉和腐霉的抑菌圈直徑在第3天為90 mm，隨著時(shí)間的延長出現(xiàn)了降低的趨勢，在第10天時(shí)對交鏈孢霉和腐霉的抑菌圈直徑分別為80、50 mm，仍遠(yuǎn)高于強(qiáng)抑菌活性的標(biāo)準(zhǔn)[17]?？梢娕Ｖ辆蛯?種霉菌均具有強(qiáng)抑制作用。關(guān)于牛至精油的抑菌效果此前也有研究報(bào)道，董路路等[18]采用濾紙片法測試出牛至精油對灰霉和青霉的抑菌圈直徑均為45 mm。PORTILLO-RUIZ等[19]測試出墨西哥牛至精油對青霉、根霉、鐮刀菌的抑菌圈直徑分別為34、35、45 mm。文獻(xiàn)中抑菌圈直徑和本實(shí)驗(yàn)存在差異，原因可能是牛至精油的成分和使用量存在差異。植物精油抑菌的作用機(jī)制主要涉及破壞微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、DNA、呼吸作用和能量代謝等方面[1]。OUSSALAH等[20]發(fā)現(xiàn)西班牙牛至精油可使大腸桿菌和李斯特菌的細(xì)胞膜通透性變大，引起細(xì)胞成分的釋放，并導(dǎo)致細(xì)胞中ATP濃度和細(xì)胞內(nèi)pH值降低。SIROLI等[21]研究了亞致死濃度的牛至精油誘導(dǎo)了李斯特菌，大腸桿菌和沙門氏菌的一些膜相關(guān)脂肪酸顯著增加，特別是不飽和脂肪酸，反式異構(gòu)體和特定釋放的游離脂肪酸，并產(chǎn)生了揮發(fā)性化合物。由于牛至精油是一種混合物，一般認(rèn)為可能是由于含有較高含量的香芹酚或百里香酚導(dǎo)致其具有優(yōu)異的抑菌性能，但是關(guān)于牛至精油抑菌活性成分的證實(shí)工作未見相關(guān)研究或報(bào)道。

表1 牛至精油對4種霉菌的抑菌圈直徑 單位：mm

2.2 牛至精油的GC-MS分析

通過GC-MS共鑒定出14種化學(xué)成分，其中峰面積百分比超過1%的成分有5種，出峰時(shí)間分別為7.807、14.224、14.439、14.837、19.581 min，對應(yīng)的成分及含量分別為鄰甲酚4.94%，百里香酚1.941%，香芹酚83.06%，3-甲基-4-異丙基苯酚1.02%，1,3-二異丙基-2-甲氧基苯6.82%。此前已有部分文獻(xiàn)對牛至精油的成分進(jìn)行了深入研究。FALCO等[12]研究了3種野生牛至精油的成分，發(fā)現(xiàn)牛至品種和采集時(shí)間會導(dǎo)致精油成分含量存在顯著差異(P<0.05)。FIGUéRéDO等[13]研究了7種牛至精油的化學(xué)成分，不同精油之間的成分也存在明顯差異，其中一種牛至精油香芹酚含量較高(香芹酚73.8%，百里香酚0.6%)，而另一種牛至精油百里香酚含量較高(香芹酚2.1%，百里香酚59.3%)。本實(shí)驗(yàn)中牛至精油的主要成分與上述文獻(xiàn)中牛至精油成分基本吻合，但是也存在差異，其原因可能是由于牛至品種之間、采集季節(jié)、以及加工方法存在差異。

2.3 牛至精油抑菌活性成分的確定

2.3.1 牛至精油處理前后抑菌效果對比分析

圖1為牛至精油處理前后對灰霉的抑菌效果，圖2為抑菌圈照片。由圖1可知，香芹酚的抑菌圈直徑比牛至精油稍大，其中1/10香芹酚標(biāo)品和1/10牛至精油對灰霉的抑菌圈直徑分別為41 mm和38 mm，均顯著高于NaOH溶液處理后的1/10牛至精油的抑菌圈直徑6 mm(P<0.05)。從圖2可直接看出NaOH溶液處理使牛至精油的抑菌效果顯著下降，培養(yǎng)皿幾乎長滿灰霉。根據(jù)GC-MS 分析結(jié)果，牛至精油中含有83.06%香芹酚和1.941%百里香酚，而酚羥基在水溶液中存在弱酸性易電離出氫離子，極易與NaOH溶液中的氫氧根離子結(jié)合生成水，導(dǎo)致酚羥基上的氫離子被NaOH溶液的鈉離子取代生成酚鈉，這與牛至精油在堿性pH值條件下紫外吸光度值發(fā)生很大變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合。

圖1 牛至精油處理前后對灰霉的抗菌效果Fig.1 Antifungal activities of oregano EO and treated oregano EO against Botrytis cinerea

a-空白對照；b-1/10香芹酚；c-1/10牛至精油；d-NaOH處理后的牛至精油圖2 牛至精油處理前后對灰霉的抑菌照片F(xiàn)ig.2 Photos of oregano EO and treated oregano EO against Botrytis cinerea

2.3.2 NaOH處理的牛至精油GC分析

香芹酚標(biāo)品和NaOH溶液處理后的牛至精油GC圖分別見圖3-a，圖3-b。在圖3中，第1個(gè)峰均為稀釋溶劑正己烷，第2個(gè)峰(出峰時(shí)間9 min左右)均為香芹酚。香芹酚是牛至精油中的主要成分，NaOH溶液處理后的牛至精油中香芹酚出峰急劇變小至幾乎沒有，這說明NaOH溶液處理后的牛至精油中僅有極少量未被完全反應(yīng)消耗掉的香芹酚。這說明了NaOH溶液處理可以破壞牛至精油中的香芹酚。

綜合以上研究分析，香芹酚為牛至精油中的抑菌活性成分，其抑菌關(guān)鍵點(diǎn)為香芹酚的酚羥基結(jié)構(gòu)，一旦酚羥基遭受破壞，牛至精油的抑菌活性將被極大地削弱。此外，牛至精油的活性成分在遭受不同條件處理時(shí)(如光照、pH值、溫度等)的穩(wěn)定性也值得進(jìn)一步深入研究。

a-香芹酚;b-NaOH溶液處理后的牛至精油圖3 香芹酚及NaOH溶液處理后的牛至精油GC圖譜Fig.3 GC spectrum of carvacrol and oregano EO treated with NaOH solution

2.4 牛至精油抑菌活性成分穩(wěn)定性分析

2.4.1 香芹酚紫外吸收波長

香芹酚乙醇溶液在217、276 nm處有2個(gè)吸收峰。3×10-5g/mL的香芹酚稀釋液在217、276 nm下的吸光度值分別為1.854和0.625。質(zhì)量濃度為3×10-4、3×10-3g/mL的香芹酚稀釋液在217、276 nm下的吸光度值均大于3.0，超出紫外分光光度計(jì)測試的精度范圍。因此確定217、276 nm為香芹酚的紫外吸收波長，3×10-5g/mL的香芹酚乙醇稀釋液為合適的紫外可見分光光度計(jì)測試用濃度。3×10-5g/mL的香芹酚乙醇稀釋液的紫外可見分光光度計(jì)掃描圖見圖4，其中1號峰波長為276 nm，2號峰波長為217 nm。盧燕霞等[15]采用紫外分光光度計(jì)對牛至精油乙醇溶液進(jìn)行全波長掃描時(shí)也得出了相似的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)香芹酚在276 nm有最大紫外吸收峰，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

圖4 香芹酚紫外掃描曲線Fig.4 UV scanning curve of carvacrol

2.4.2 光照時(shí)間對香芹酚穩(wěn)定性的影響

不同光照時(shí)間對香芹酚紫外吸光度值的影響見圖5-a。隨著光照時(shí)間的增加，香芹酚的紫外吸光度值無明顯變化，光照8 h后吸光度值仍無顯著變化(P>0.05)，這說明香芹酚分子結(jié)構(gòu)在自然光照條件下未發(fā)生改變，也即自然光照對香芹酚的穩(wěn)定性無影響。

2.4.3 60 ℃處理對香芹酚穩(wěn)定性的影響

60 ℃恒溫水浴處理不同時(shí)間對香芹酚紫外吸光度值的影響見圖5-b。隨著處理時(shí)間的增加，香芹酚吸光度值無明顯變化，8 h后吸光度值仍無顯著變化(P>0.05)，這說明香芹酚分子結(jié)構(gòu)在60 ℃處理?xiàng)l件下未發(fā)生改變，也即60 ℃處理對香芹酚的穩(wěn)定性無顯著影響。

2.4.4 不同濕度對香芹酚穩(wěn)定性的影響

不同濕度條件對香芹酚紫外吸光度值的影響見圖5-c。在不同濕度條件下隨著時(shí)間的延長，香芹酚的吸光度值沒有明顯的變化，處理8 d后，吸光度值仍無顯著差異(P>0.05)。這說明不同濕度處理對香芹酚的穩(wěn)定性無顯著影響。

2.4.5 不同pH值對香芹酚穩(wěn)定性的影響

不同pH值對香芹酚紫外吸光度值的影響見圖5-d。在pH值為2～10香芹酚乙醇溶液的吸光度值無明顯差異(P>0.05)，隨著pH值的增加，吸光度值上升，特別是pH值達(dá)到13，吸光度值出現(xiàn)大幅變化。這表明香芹酚在酸性和中性條件下穩(wěn)定，在強(qiáng)堿環(huán)境中極不穩(wěn)定。這是因?yàn)橄闱鄯优cNaOH溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，破壞了香芹酚原本的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其紫外吸光度值發(fā)生顯著變化，這一現(xiàn)象與NaOH溶液處理后的牛至精油GC分析結(jié)果相吻合。劉萬臣[14]用不同pH值條件處理丁香酚時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，在強(qiáng)堿性pH值條件下丁香酚的紫外吸光度值也出現(xiàn)了較大變化。

a-光照；b-60 ℃水浴處理；c-不同濕度處理；d-不同pH處理圖5 不同處理?xiàng)l件對香芹酚穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of different treatment conditions on the stability of carvacrol

2.5 抗菌紙箱內(nèi)香芹酚釋放特性分析

抗菌紙箱內(nèi)香芹酚氣體相對含量的變化見圖6。試劑瓶中香芹酚在GC中出峰面積為759 598.5。各組抗菌紙箱中釋放的香芹酚相對含量隨著牛至精油濃度增加而增大，并隨著時(shí)間的延長均出現(xiàn)下降趨勢，在第1天時(shí)，T1、T2、T3、T4抗菌紙箱內(nèi)香芹酚的相對含量分別為 2.66%、6.61%、32.17%、43.47%，在第4天時(shí)分別減少為2.02%、3.57%、6.63%、10.18%。類似的研究也有報(bào)道，如ECHEGOYEN等[22]采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定了2種肉桂精油活性紙釋放出的肉桂醛濃度，其中基于石蠟乳液的活性紙中釋放出肉桂醛12～18 μg/mL，基于固體石蠟的活性紙釋放的肉桂醛約為4 μg/mL。本實(shí)驗(yàn)測試香芹酚釋放特性采用直接從抗菌紙箱中抽取氣體的方式測量，香芹酚在紙箱中會存在損失，所以測試出的香芹酚釋放量與紙箱抗菌涂層中實(shí)際釋放出的香芹酚存在差異。依據(jù)抗菌紙箱中的緩釋曲線，該牛至精油抗菌紙箱比較適合于草莓等貨架壽命比較短的果蔬等農(nóng)產(chǎn)品的保鮮包裝。在抗菌涂層中添加多孔吸附材料或?qū)ν繉优浞竭M(jìn)行改進(jìn)以期獲得更佳的緩釋效果值得進(jìn)一步深入研究。

圖6 抗菌紙箱內(nèi)香芹酚相對含量變化Fig.6 Changes in relative content of carvacrol in antimicrobial carton

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究分析了牛至精油對4種霉菌的抑菌活性及化學(xué)成分組成，著重對牛至精油的抑菌活性成分進(jìn)行了研究，同時(shí)探討了光照、溫度、濕度、不同pH值對活性成分穩(wěn)定性的影響，并以牛至精油涂布紙箱為例研究了牛至精油活性成分的釋放規(guī)律。研究表明牛至精油對灰霉等4種霉菌具有強(qiáng)抑制活性，其主要成分及抑菌活性成分均是香芹酚，強(qiáng)堿條件會影響香芹酚的紫外吸光度值并破壞牛至精油的抑菌活性，自然光照、不同濕度以及60 ℃處理對香芹酚穩(wěn)定性影響不顯著。香芹酚在牛至精油抗菌紙箱中的釋放規(guī)律表明,3%的牛至精油抗菌紙箱中香芹酚含量高于其他組抗菌紙箱，在第4天的相對含量仍為10.18%。本研究為植物源酚類抑菌劑在果蔬防腐保鮮中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。