何輝立，方 彥,馬 驪，孫柏林，劉麗君，武軍艷，董 云,4，孫萬倉，金嬌嬌，李學(xué)才

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070; 2.甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心, 蘭州 730070; 3.河北中旭檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)有限公司, 石家莊 050200；4.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,蘭州 730070)

植物早期光誘導(dǎo)蛋白(early light-induced protein, ELIPs)是核基因編碼的葉綠體類囊體膜蛋白[1]，屬于葉綠素結(jié)合蛋白超家族(chlorophyll a/b binding superfamily, CABs)。其最早發(fā)現(xiàn)于黃化豌豆幼苗去黃化試驗(yàn)中[2]，具有光保護(hù)作用[3]。ELIP蛋白也是一種逆境脅迫響應(yīng)蛋白，植物在受到高鹽[4]、干旱和低溫等多種非生物脅迫時(shí)體內(nèi)ELIP被誘導(dǎo)且表達(dá)量提高[5]。低溫脅迫是ELIP基因表達(dá)的主要誘導(dǎo)因素之一[3]。低溫馴化過程中，豌豆(PisumsativumLinn)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、擬南芥[8](Arabidopsisthaliana)和鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)[9]等多種物種ELIP基因被誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)提高植物抗寒性十分重要。Shimosaka等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小麥中ELIP在低溫脅迫過程中被大量誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有增強(qiáng)植物抵御抗寒的能力。在冷馴化中誘導(dǎo)表達(dá)ELIP基因有助于紫花苜蓿falcata抗寒性的提高[11]。

白菜型冬油菜是北方旱寒區(qū)一種重要的越冬經(jīng)濟(jì)作物，可在北方不同生態(tài)區(qū)正常越冬[12]，蘊(yùn)藏著豐富的抗寒基因，是研究植物抗寒性及獲得抗寒基因的重要材料。甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期在用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法篩選白菜型冬油菜的冷誘導(dǎo)差異基因時(shí)，從數(shù)據(jù)庫篩選和鑒定出參與低溫誘導(dǎo)途徑的ELIP1基因，為進(jìn)一步研究ELIP1基因在白菜型冬油菜低溫脅迫中的功能，本試驗(yàn)克隆8個(gè)不同抗寒性冬油菜品種葉片中的ELIP1基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)該基因的結(jié)構(gòu)和功能，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究不同抗寒性冬油菜品種在低溫脅迫下的表達(dá)模式，研究結(jié)果有助于理解ELIP1基因在冬油菜抗寒性中的作用，并對(duì)后期開展的抗寒育種有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取8份白菜型冬油菜為試驗(yàn)材料，來源及特性見表1。

表1 品種名稱與來源

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽試驗(yàn)，將籽粒飽滿的各品種油菜種子播種至裝有育苗基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中(9 cm×7.5 cm)，每缽4株，放置于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園溫室大棚中，培養(yǎng)至五葉期。選取健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的不同油菜幼苗在25 ℃(CK，光照14 h，黑暗10 h)和 4 ℃(光照14 h，黑暗10 h)各處理2 d，取第5片真葉用錫箔紙包裹，液氮速凍后放于-70 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 參照天根試劑盒DP419說明書提取各樣品總RNA，電泳檢測(cè)后，按TaKaRa cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036A)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到單鏈cDNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度后置于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與ELIP1基因克隆 以實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為依據(jù)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)cDNA擴(kuò)增引物，ELIP1-F：5′-ATGGCAATGGCGTCGTTTAACATG-3′；ELIP1-R：5′-TCAAACGAGAGTCCCACCCTTGA-3′，以4 ℃低溫處理后各品種葉片提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小，普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收目的條帶，將其連接到pMD-19T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)12 h后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑至含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中搖菌。菌落PCR驗(yàn)證的陽性克隆，隨機(jī)挑選3個(gè)送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行克隆結(jié)果測(cè)序。

1.3.3 ELIP1預(yù)測(cè)蛋白的生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析采用Protparam；采用Protscale分析氨基酸疏水性?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用TMpred Server軟件。利用SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽。利用SOPMA工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[13]。NCBI CD-search預(yù)測(cè)ELIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN軟件比較8個(gè)白菜型冬油菜品種中ELIP1基因核苷酸序列的同源性。

1.4 白菜型冬油菜 ELIP1基因的熒光定量表達(dá)分析

根據(jù)獲得的ELIP1基因的CDS序列，設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物，ELIP1-F：5′-GAGATGTATGGCTGAG GGAGAA-3′和ELIP1-R：5′-GAGGTGGCGACGATGACTT-3′；內(nèi)參基因β-actin引物，F(xiàn)：5′-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3′；R：5′-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3′，以濃度一致的8個(gè)冬油菜品種常溫及低溫處理后葉片cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，PCR擴(kuò)增條件同上。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。低溫差異表達(dá)分析以常溫對(duì)照(CK)的表達(dá)量為基準(zhǔn)。3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELIP1基因克隆

通過‘隴油7號(hào)’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)一條ELIP1基因序列，該基因具有完整編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為550 bp。本研究以低溫下8個(gè)白菜型冬油菜葉片cDNA和特異性引物為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增，得到一條550 bp左右(圖1)的擴(kuò)增產(chǎn)物，與數(shù)據(jù)庫中ELIP1基因長(zhǎng)度吻合。純化回收目的條帶，連接T載體并轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證挑選陽性克隆(圖2)，得到的目的片段大小在550 bp左右，說明克隆的ELIP1已插入載體中。將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，得到長(zhǎng)度為588 bp的編碼區(qū) 序列。

圖1 白菜型油菜 ELIP1基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 白菜型油菜 ELIP1基因菌液PCR鑒定結(jié)果

2.2 白菜型冬油菜 ELIP1基因編碼蛋白質(zhì)的特性分析

對(duì)‘隴油7號(hào)’ELIP1基因的堿基序列進(jìn)行開放閱讀框分析，結(jié)果顯示ELIP1基因CDS區(qū)含有一個(gè)長(zhǎng)度為588 bp 的完整開放閱讀框(ORF)，編碼含195個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’ELIP1蛋白由20種氨基酸組成，其中Ala占11.3%，Leu占10.3%；含有13個(gè)酸性氨基酸(D、E)，18個(gè)堿性氨基酸(K、R)，76個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)，47個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)及36個(gè)帶電荷的氨基酸(R、K、H、Y、C、D、E)；預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為9.24；相對(duì)分子質(zhì)量為 20.472 8 ku；預(yù)測(cè)不穩(wěn)定指數(shù)為39.35，是一個(gè)穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)穩(wěn)定)；總平均親水指數(shù)為 0.169，為疏水性蛋白(圖4)。

圖4 ELIP1蛋白的疏水性預(yù)測(cè)分析

蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析表明白菜型冬油菜ELIP1蛋白信號(hào)肽序列沒有斷裂(圖5)?！]油7號(hào)’ELIP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)由α-螺旋(alpha hELIP1x，43.08%)，延伸鏈(extended strand，11.79%)，β-轉(zhuǎn)角(beta turn，5.13%)和無規(guī)則卷曲(random coil，40%)組成。

圖5 預(yù)測(cè)白菜型冬油菜ELIP1蛋白信號(hào)肽

藍(lán)色.α螺旋；紫色.無規(guī)則卷曲；紅色.延伸鏈；綠色.β轉(zhuǎn)角。橫坐標(biāo)數(shù)值表示氨基酸序列位置

利用NCBI CD-search預(yù)測(cè)ELIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域(圖7)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明ELIP1含有葉綠素A-B結(jié)合蛋白家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，該保守結(jié)構(gòu)區(qū)域是由93(96～188)個(gè)氨基酸組成，說明ELIP1是一種參與光合作用的功能蛋白。

圖7 白菜型冬油菜ELIP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3 各品種白菜型冬油菜 ELIP1基因核苷酸序列對(duì)比

利用DNAMAN軟件對(duì)不同白菜型冬油菜品種ELIP1基因進(jìn)行比較(圖8)，8個(gè)品種ELIP1基因同源性為99.06%。與參考序列白菜型油菜(XM_009137582)對(duì)比，ELIP1基因在8個(gè)冬油菜品種中共有21處(圖8)堿基發(fā)生突變，其中弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’各發(fā)生一處突變，強(qiáng)抗寒品種‘隴油8號(hào)’堿基突變最多，出現(xiàn)18處，其他5個(gè)品種發(fā)生15～17處變異，說明不同白菜型冬油菜品種在進(jìn)化中ELIP1基因序列存在單核苷酸多態(tài)性。

圖8 8個(gè)白菜型油菜品種 ELIP1序列對(duì)比結(jié)果

2.4 各白菜型冬油菜品種ELIP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建與分析

利用MEGA 7.0中鄰近法原則對(duì)8個(gè)白菜型冬油菜ELIP1構(gòu)建了進(jìn)化樹(圖9)，結(jié)果顯示國(guó)外品種‘Lenox’和‘Neib’聚為一類；其他6個(gè)國(guó)內(nèi)品種聚為一大類，表明國(guó)外和國(guó)內(nèi)品種其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖9 ELIP1蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.5 低溫脅迫對(duì)不同冬油菜品種ELIP1表達(dá)的影響

通過比較不同冬油菜品種在常溫和低溫處理后ELIP1 表達(dá)水平(圖10)，發(fā)現(xiàn)4℃時(shí)，超強(qiáng)抗寒品種‘隴油6號(hào)’和‘隴油7號(hào)’的ELIP1基因表達(dá)量高于25 ℃，分別上調(diào)了47.99%和 40.46%，其他品種低溫下的表達(dá)量均低于常溫，且抗寒性越弱，低溫下表達(dá)量越低。其中抗寒品種‘隴油8號(hào)’和‘隴油9號(hào)’較25 ℃分別下調(diào)了8.88%和5.40%，耐寒品種‘天油2號(hào)’和‘天油4號(hào)’較25 ℃分別下調(diào)了49.14%和40.96%，弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’在4 ℃時(shí)ELIP1基因下調(diào)了99.51%和98.28%，表達(dá)量很少。

不同小寫字母表示不同品種 ELIP1表達(dá)量在不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從白菜型冬油菜葉片克隆獲得1條含有完整ORF的ELIP1基因，其氨基酸序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中ELIP1基因序列吻合率為 99.06%，生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼195個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為9.24；相對(duì)分子質(zhì)量為 20.472 8 ku；編碼主要由a-螺旋和無規(guī)則卷曲組成的疏水性穩(wěn)定蛋白。8個(gè)油菜品種核苷酸序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，ELIP1基因存在21處突變，其中弱抗寒品種發(fā)生突變位置少于抗寒品種；對(duì)8個(gè)白菜型冬油菜ELIP1構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩個(gè)國(guó)外引進(jìn)弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’聚為一類，‘天油2號(hào)’‘天油4號(hào)’‘隴油6號(hào)’‘隴油7號(hào)’‘隴油8號(hào)’和‘隴油9號(hào)’聚為一大類，表明國(guó)外和國(guó)內(nèi)品種其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可能是弱抗寒品種與抗寒品種存在抗寒性差異的主要影響因素。

目前，已在許多物種中克隆出了ELIP基因[14-15]，該基因在受到逆境脅迫時(shí)表達(dá)量升高，對(duì)抵御不同逆境起著重要作用[3]。Montané等[7]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度在5～25 ℃時(shí)，隨著溫度的下降和脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，ELIP基因被誘導(dǎo)程度越高，表達(dá)顯著上升。Wei等[16]、Peng等[14]、何飛等[17]、Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，低溫馴化過程中，植物ELIP基因表達(dá)量上調(diào)，對(duì)提高植物抗寒性十分重要。本研究對(duì)8個(gè)不同冬油菜品種葉片中ELIP1基因的表達(dá)分析顯示，4 ℃時(shí)，抗寒性越強(qiáng)的品種ELIP1基因表達(dá)量越高，表明ELIP1基因可能在冬油菜響應(yīng)低溫脅迫提高自身抗寒性中發(fā)揮重要作用。