何輝立,方 彥,馬 驪,孫柏林,劉麗君,武軍艷,董 云,4,孫萬倉,金嬌嬌,李學(xué)才
(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730070; 2.甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心, 蘭州 730070; 3.河北中旭檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)有限公司, 石家莊 050200;4.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,蘭州 730070)
植物早期光誘導(dǎo)蛋白(early light-induced protein, ELIPs)是核基因編碼的葉綠體類囊體膜蛋白[1],屬于葉綠素結(jié)合蛋白超家族(chlorophyll a/b binding superfamily, CABs)。其最早發(fā)現(xiàn)于黃化豌豆幼苗去黃化試驗(yàn)中[2],具有光保護(hù)作用[3]。ELIP蛋白也是一種逆境脅迫響應(yīng)蛋白,植物在受到高鹽[4]、干旱和低溫等多種非生物脅迫時(shí)體內(nèi)ELIP被誘導(dǎo)且表達(dá)量提高[5]。低溫脅迫是ELIP基因表達(dá)的主要誘導(dǎo)因素之一[3]。低溫馴化過程中,豌豆(PisumsativumLinn)[6]、大麥(Hordeumvulgare)[7]、擬南芥[8](Arabidopsisthaliana)和鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)[9]等多種物種ELIP基因被誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)提高植物抗寒性十分重要。Shimosaka等[10]研究發(fā)現(xiàn),小麥中ELIP在低溫脅迫過程中被大量誘導(dǎo)產(chǎn)生,具有增強(qiáng)植物抵御抗寒的能力。在冷馴化中誘導(dǎo)表達(dá)ELIP基因有助于紫花苜蓿falcata抗寒性的提高[11]。
白菜型冬油菜是北方旱寒區(qū)一種重要的越冬經(jīng)濟(jì)作物,可在北方不同生態(tài)區(qū)正常越冬[12],蘊(yùn)藏著豐富的抗寒基因,是研究植物抗寒性及獲得抗寒基因的重要材料。甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期在用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法篩選白菜型冬油菜的冷誘導(dǎo)差異基因時(shí),從數(shù)據(jù)庫篩選和鑒定出參與低溫誘導(dǎo)途徑的ELIP1基因,為進(jìn)一步研究ELIP1基因在白菜型冬油菜低溫脅迫中的功能,本試驗(yàn)克隆8個(gè)不同抗寒性冬油菜品種葉片中的ELIP1基因,運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)該基因的結(jié)構(gòu)和功能,并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究不同抗寒性冬油菜品種在低溫脅迫下的表達(dá)模式,研究結(jié)果有助于理解ELIP1基因在冬油菜抗寒性中的作用,并對(duì)后期開展的抗寒育種有一定參考意義。
選取8份白菜型冬油菜為試驗(yàn)材料,來源及特性見表1。
表1 品種名稱與來源
采用盆栽試驗(yàn),將籽粒飽滿的各品種油菜種子播種至裝有育苗基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中(9 cm×7.5 cm),每缽4株,放置于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)校園溫室大棚中,培養(yǎng)至五葉期。選取健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的不同油菜幼苗在25 ℃(CK,光照14 h,黑暗10 h)和 4 ℃(光照14 h,黑暗10 h)各處理2 d,取第5片真葉用錫箔紙包裹,液氮速凍后放于-70 ℃超低溫冰箱保存,備用。
1.3.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 參照天根試劑盒DP419說明書提取各樣品總RNA,電泳檢測(cè)后,按TaKaRa cDNA第一鏈合成試劑盒(RR036A)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到單鏈cDNA,超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度后置于-20 ℃冰箱保存,備用。
1.3.2 引物設(shè)計(jì)與ELIP1基因克隆 以實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果為依據(jù),利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)cDNA擴(kuò)增引物,ELIP1-F:5′-ATGGCAATGGCGTCGTTTAACATG-3′;ELIP1-R:5′-TCAAACGAGAGTCCCACCCTTGA-3′,以4 ℃低溫處理后各品種葉片提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min;4 ℃保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小,普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(離心柱型)回收目的條帶,將其連接到pMD-19T載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,在含有Amp、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上,過夜培養(yǎng)12 h后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白斑至含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中搖菌。菌落PCR驗(yàn)證的陽性克隆,隨機(jī)挑選3個(gè)送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行克隆結(jié)果測(cè)序。
1.3.3 ELIP1預(yù)測(cè)蛋白的生物信息學(xué)分析 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析采用Protparam;采用Protscale分析氨基酸疏水性??缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用TMpred Server軟件。利用SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽。利用SOPMA工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[13]。NCBI CD-search預(yù)測(cè)ELIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN軟件比較8個(gè)白菜型冬油菜品種中ELIP1基因核苷酸序列的同源性。
根據(jù)獲得的ELIP1基因的CDS序列,設(shè)計(jì)定量表達(dá)引物,ELIP1-F:5′-GAGATGTATGGCTGAG GGAGAA-3′和ELIP1-R:5′-GAGGTGGCGACGATGACTT-3′;內(nèi)參基因β-actin引物,F(xiàn):5′-TGTGCCAATCTACGAGGGTTT-3′;R:5′-TTTCCCGCTCTGCTGTTGT-3′,以濃度一致的8個(gè)冬油菜品種常溫及低溫處理后葉片cDNA為模板,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析,PCR擴(kuò)增條件同上。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。低溫差異表達(dá)分析以常溫對(duì)照(CK)的表達(dá)量為基準(zhǔn)。3次重復(fù)。
通過‘隴油7號(hào)’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)一條ELIP1基因序列,該基因具有完整編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄本,長(zhǎng)度為550 bp。本研究以低溫下8個(gè)白菜型冬油菜葉片cDNA和特異性引物為模板,用RT-PCR方法擴(kuò)增,得到一條550 bp左右(圖1)的擴(kuò)增產(chǎn)物,與數(shù)據(jù)庫中ELIP1基因長(zhǎng)度吻合。純化回收目的條帶,連接T載體并轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證挑選陽性克隆(圖2),得到的目的片段大小在550 bp左右,說明克隆的ELIP1已插入載體中。將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序,得到長(zhǎng)度為588 bp的編碼區(qū) 序列。
圖1 白菜型油菜 ELIP1基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
圖2 白菜型油菜 ELIP1基因菌液PCR鑒定結(jié)果
對(duì)‘隴油7號(hào)’ELIP1基因的堿基序列進(jìn)行開放閱讀框分析,結(jié)果顯示ELIP1基因CDS區(qū)含有一個(gè)長(zhǎng)度為588 bp 的完整開放閱讀框(ORF),編碼含195個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明,白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’ELIP1蛋白由20種氨基酸組成,其中Ala占11.3%,Leu占10.3%;含有13個(gè)酸性氨基酸(D、E),18個(gè)堿性氨基酸(K、R),76個(gè)疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V),47個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)及36個(gè)帶電荷的氨基酸(R、K、H、Y、C、D、E);預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為9.24;相對(duì)分子質(zhì)量為 20.472 8 ku;預(yù)測(cè)不穩(wěn)定指數(shù)為39.35,是一個(gè)穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)穩(wěn)定);總平均親水指數(shù)為 0.169,為疏水性蛋白(圖4)。
圖4 ELIP1蛋白的疏水性預(yù)測(cè)分析
蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析表明白菜型冬油菜ELIP1蛋白信號(hào)肽序列沒有斷裂(圖5)?!]油7號(hào)’ELIP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)由α-螺旋(alpha hELIP1x,43.08%),延伸鏈(extended strand,11.79%),β-轉(zhuǎn)角(beta turn,5.13%)和無規(guī)則卷曲(random coil,40%)組成。
圖5 預(yù)測(cè)白菜型冬油菜ELIP1蛋白信號(hào)肽
藍(lán)色.α螺旋;紫色.無規(guī)則卷曲;紅色.延伸鏈;綠色.β轉(zhuǎn)角。橫坐標(biāo)數(shù)值表示氨基酸序列位置
利用NCBI CD-search預(yù)測(cè)ELIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域(圖7),預(yù)測(cè)結(jié)果表明ELIP1含有葉綠素A-B結(jié)合蛋白家族特有的保守結(jié)構(gòu)域,該保守結(jié)構(gòu)區(qū)域是由93(96~188)個(gè)氨基酸組成,說明ELIP1是一種參與光合作用的功能蛋白。
圖7 白菜型冬油菜ELIP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析
利用DNAMAN軟件對(duì)不同白菜型冬油菜品種ELIP1基因進(jìn)行比較(圖8),8個(gè)品種ELIP1基因同源性為99.06%。與參考序列白菜型油菜(XM_009137582)對(duì)比,ELIP1基因在8個(gè)冬油菜品種中共有21處(圖8)堿基發(fā)生突變,其中弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’各發(fā)生一處突變,強(qiáng)抗寒品種‘隴油8號(hào)’堿基突變最多,出現(xiàn)18處,其他5個(gè)品種發(fā)生15~17處變異,說明不同白菜型冬油菜品種在進(jìn)化中ELIP1基因序列存在單核苷酸多態(tài)性。
圖8 8個(gè)白菜型油菜品種 ELIP1序列對(duì)比結(jié)果
利用MEGA 7.0中鄰近法原則對(duì)8個(gè)白菜型冬油菜ELIP1構(gòu)建了進(jìn)化樹(圖9),結(jié)果顯示國(guó)外品種‘Lenox’和‘Neib’聚為一類;其他6個(gè)國(guó)內(nèi)品種聚為一大類,表明國(guó)外和國(guó)內(nèi)品種其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
圖9 ELIP1蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
通過比較不同冬油菜品種在常溫和低溫處理后ELIP1 表達(dá)水平(圖10),發(fā)現(xiàn)4℃時(shí),超強(qiáng)抗寒品種‘隴油6號(hào)’和‘隴油7號(hào)’的ELIP1基因表達(dá)量高于25 ℃,分別上調(diào)了47.99%和 40.46%,其他品種低溫下的表達(dá)量均低于常溫,且抗寒性越弱,低溫下表達(dá)量越低。其中抗寒品種‘隴油8號(hào)’和‘隴油9號(hào)’較25 ℃分別下調(diào)了8.88%和5.40%,耐寒品種‘天油2號(hào)’和‘天油4號(hào)’較25 ℃分別下調(diào)了49.14%和40.96%,弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’在4 ℃時(shí)ELIP1基因下調(diào)了99.51%和98.28%,表達(dá)量很少。
不同小寫字母表示不同品種 ELIP1表達(dá)量在不同溫度處理間差異顯著(P<0.05)。
本試驗(yàn)從白菜型冬油菜葉片克隆獲得1條含有完整ORF的ELIP1基因,其氨基酸序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中ELIP1基因序列吻合率為 99.06%,生物信息學(xué)分析表明,該基因編碼195個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為9.24;相對(duì)分子質(zhì)量為 20.472 8 ku;編碼主要由a-螺旋和無規(guī)則卷曲組成的疏水性穩(wěn)定蛋白。8個(gè)油菜品種核苷酸序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),ELIP1基因存在21處突變,其中弱抗寒品種發(fā)生突變位置少于抗寒品種;對(duì)8個(gè)白菜型冬油菜ELIP1構(gòu)建進(jìn)化樹進(jìn)行分析,結(jié)果顯示兩個(gè)國(guó)外引進(jìn)弱抗寒品種‘Lenox’和‘Neib’聚為一類,‘天油2號(hào)’‘天油4號(hào)’‘隴油6號(hào)’‘隴油7號(hào)’‘隴油8號(hào)’和‘隴油9號(hào)’聚為一大類,表明國(guó)外和國(guó)內(nèi)品種其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這可能是弱抗寒品種與抗寒品種存在抗寒性差異的主要影響因素。
目前,已在許多物種中克隆出了ELIP基因[14-15],該基因在受到逆境脅迫時(shí)表達(dá)量升高,對(duì)抵御不同逆境起著重要作用[3]。Montané等[7]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度在5~25 ℃時(shí),隨著溫度的下降和脅迫時(shí)間延長(zhǎng),ELIP基因被誘導(dǎo)程度越高,表達(dá)顯著上升。Wei等[16]、Peng等[14]、何飛等[17]、Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn),低溫馴化過程中,植物ELIP基因表達(dá)量上調(diào),對(duì)提高植物抗寒性十分重要。本研究對(duì)8個(gè)不同冬油菜品種葉片中ELIP1基因的表達(dá)分析顯示,4 ℃時(shí),抗寒性越強(qiáng)的品種ELIP1基因表達(dá)量越高,表明ELIP1基因可能在冬油菜響應(yīng)低溫脅迫提高自身抗寒性中發(fā)揮重要作用。