張仁文

(吉林化工學院，吉林 吉林 132022)

1 引言

肝癌作為全球死亡率極高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命與健康，因此尋找有效的治療手段愈發(fā)重要。肝癌細胞有增殖迅速這一特征，這種極速增殖是由肝癌細胞中異常的脂質代謝引起的[1，2]。脂質代謝一方面增強肝癌細胞能量的獲取來促進細胞增殖和轉移，另一方面脂質代謝產物還可以作為信號分子用來加強細胞信號的傳遞[3，4]。膽固醇是細胞中的天然組分，其不僅是細胞膜的主要成分也是體內多種活性物質合成的前體分子。有研究表明細胞內膽固醇代謝紊亂能引起一系列疾病[5]，然而外源性膽固醇在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用仍未得到充分研究。因此本實驗將探究外源膽固醇對肝癌細胞活力的影響，并進一步觀察對細胞脂質代謝中關鍵基因表達的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗細胞

人肝癌細胞系HepG2。

2.2 實驗藥品

DMEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、膽固醇、CCK-8、逆轉錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒。

2.3 實驗方法

2.3.1 CCK-8檢測細胞活力

HepG2細胞培養(yǎng)至約80%匯合度時，胰酶消化并計數(shù)，以每孔5000個細胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜。配制不同膽固醇濃度的培養(yǎng)基并替換96孔板培養(yǎng)基，膽固醇濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100mg/L，每個濃度設置4個復孔，其中0mg/L為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)(37℃，5% CO2)。培養(yǎng)24 h后向每孔加入10μL CCK-8溶液，用移液器吹打混勻，將96孔板在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)培育2h，用酶標儀測定各孔在450nm處的吸光度。

2.3.2 qRT-PCR檢測脂代謝相關基因表達情況

1、樣品RNA的提取

將HepG2細胞以2×105個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。分別加入含0，12.5，100mg/L膽固醇的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束后采用Trizol法提取各孔細胞總RNA。分光光度法測定提取的總RNA的純度和濃度，于-80℃保存待用。

2、樣品cDNA合成

每組取1μg總RNA用于進行逆轉錄反應，按試劑盒說明書將總RNA、buff溶液、引物和DEPC水在冰上混勻制備20μL反應體系。將各PCR管置于PCR儀中，42℃反應15 min，隨后85℃加熱5s失活逆轉錄酶，即得各組cDNA產物，于-20℃保存。

3、qRT-PCR檢測

上述cDNA溶液稀釋100倍后用作qRT-PCR檢測的模板，每孔模板量為2μL。將各基因上下游引物、qRT-PCR預混溶液和ddH2O在冰上混勻后分裝到8聯(lián)排中，每孔18μL，每孔再加入2μL模板溶液制備為20μL反應體系，上機檢測。每個基因設置3個復孔，反應結束后讀取各孔Ct值，計算各組各基因表達的變化，以GAPDH為內參基因。

3 實驗結果與討論

3.1 膽固醇對HepG2細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測不同濃度膽固醇對HepG2細胞活力的影響，結果見圖1。膽固醇能顯著抑制HepG2細胞活性。在低濃度膽固醇作用下，細胞活力降低不明顯，隨著膽固醇濃度的增加，細胞活力顯著降低，呈現(xiàn)劑量依賴性。在最高濃度100mg/L膽固醇作用下，細胞活力下降了約46%，與對照組相比具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

圖1 膽固醇對HepG2細胞活力的影響

3.2 膽固醇對脂代謝通路基因表達的影響

以0mg/L膽固醇處理細胞為對照組，分別觀察低濃度膽固醇(12.5mg/L)和高濃度膽固醇(100mg/L)對HepG2細胞中脂代謝相關基因FASN、SREBP-1c、ACC1、SCD1和CPT1的表達變化。采用相對定量法，以GAPDH為內參基因。結果見圖2。

圖2 脂代謝相關基因表達變化

根據(jù)圖2可知，與對照組相比，低膽固醇(12.5mg/L)處理對HepG2細胞中脂代謝相關基因的表達影響較小，其中FASN、ACC1、SCD1和CPT1基因的表達與對照組相比，無統(tǒng)計學差異，僅SREBP-1c基因表達略有下調，約為對照的0.85倍，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而高濃度膽固醇處理則顯著降低了HepG2細胞中FASN、SREBP-1c和ACC1基因的表達，分別為對照組的0.34倍、0.46倍和0.26倍，具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。高濃度膽固醇處理后HepG2細胞中SCD1基因表達亦受到抑制，為對照組的0.69倍，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而CPT1基因的表達則不受膽固醇的影響，無論低濃度還是高濃度膽固醇處理，表達與對照組相比均無變化，無統(tǒng)計學意義。

4 結論

通過以上研究我們證明，外源膽固醇能夠抑制肝癌HepG2的細胞活力，呈現(xiàn)劑量依賴關系。進一步研究發(fā)現(xiàn)，高濃度膽固醇能夠影響HepG2細胞中脂代謝相關基因FASN、SREBP-1c、ACC1和SCD1的表達，而對CPT1基因表達無影響，表明膽固醇可能通過SREBP-1c-FASN途徑影響HepG2細胞中甘油三脂的合成[6]，也可能通過抑制SCD1基因的表達來抑制SCD1-AMPK通路從而達到抑制HepG2細胞的活性[7]。然而外源膽固醇抑制細胞活力以及影響HepG2細胞中脂代謝相關基因表達的機制仍不十分清楚，尚需進一步研究證明。