賴 幸 陰 強(qiáng) 呂家煒

(東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013)

0 引言

自1983年Brus等[1]發(fā)現(xiàn)CdS量子點以來，量子點憑借發(fā)射波長可調(diào)、吸收峰寬、熒光量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點逐漸成為納米材料領(lǐng)域的研究熱點。之后，CdSe、CdTe量子點等[2]含重金屬量子點的研究也逐漸增加，但重金屬元素使量子點具有生物毒性，限制了其應(yīng)用，開發(fā)無毒性的量子點成為新的研究方向。2004年，Xu等[3]在分離、提純單壁碳納米管時首次發(fā)現(xiàn)了C-dots，之后C-dots引起了廣泛關(guān)注，已被應(yīng)用到催化、生物和光電等領(lǐng)域[4]。相比于傳統(tǒng)無機(jī)半導(dǎo)體量子點，C-dots的熒光量子產(chǎn)率低。為了解決這個問題，研究人員通過氮摻雜去增加C-dots的活性位點和量子產(chǎn)率[5]。然而，現(xiàn)有的摻雜方式條件苛刻，摻入的氮元素含量低且僅存在于C-dots表面，限制了其應(yīng)用[6，7]。因此，研究人員致力于開發(fā)一種以氮元素為基礎(chǔ)的新型納米材料。2014年湯新景課題組首先提出N-dots，該量子點具有水溶性好、光穩(wěn)定性優(yōu)異和生物相容性好等優(yōu)點[8]，在分析檢測、熒光標(biāo)記、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本文綜述了N-dots的制備方法以及在分析檢測、熒光標(biāo)記、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，展望了N-dots在未來的發(fā)展方向。

1 制備方法

目前，N-dots的制備方法主要有水熱法、微波法和光化學(xué)法三種方法。

1.1 水熱法

水熱法是一種簡便、低成本且環(huán)境友好的納米材料合成方法。Chen等[8]將2-疊氮咪唑在甲醇中以一定溫度加熱24h，制備了不同粒徑的N-dots，其氮含量最高可達(dá)34.48%。為了減少反應(yīng)時間，Gu等[9]將氨水作為親核試劑引入甲苯、2-疊氮咪唑和芐基三甲基溴化銨體系混合加熱，在水熱反應(yīng)過程中，氨水不僅參與了開環(huán)反應(yīng)，還促使N-dots的合成、表面鈍化以及功能化三個過程同時完成，反應(yīng)效率顯著提高，2小時即可制得平均粒徑5.5nm的N-dots。制備氮含量高的N-dots是研究人員一直致力于攻克的難題，Zheng等[10]以5-氨基四唑為原料，將其溶于水在200℃下加熱，獲得了粒徑范圍在2-5nm的N-dots。引人關(guān)注的是，該方法制備的N-dots氮元素含量高達(dá)57.27%，是碳元素含量的1.6倍，如此高的氮含量是之前從未報道過的。盡管水熱法被廣泛應(yīng)用，但是水熱法制備周期長，制備的穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，且關(guān)于晶體生長過程影響因素的控制缺乏深入研究。因此，尋找高效的N-dots制備方法迫在眉睫。

1.2 微波法

基于微波升溫迅速、溫度梯度小和穿透力強(qiáng)等優(yōu)勢[11]，2008年，Zhu等[12]首次提出利用微波法一步快速合成C-dots。Tang等[13]用微波對2-疊氮咪唑和氨水進(jìn)行加熱，僅用8分鐘制得了表面富含氨基的N-dots。微波合成的N-dots性能優(yōu)異，熒光量子產(chǎn)率高達(dá)34%，氮含量達(dá)到40%。在N-dots生成的同時，氨水不僅參與了開環(huán)反應(yīng)，同時也參與了N-dots的表面鈍化。雖然微波法方便、快捷，但是對溫度和時間的控制要求比較嚴(yán)格，量子點尺寸難以控制[14，15]。

圖1 微波法制備N-dots原理圖[13]

1.3 光化學(xué)法

光化學(xué)法具有反應(yīng)時間短、綠色快捷、反應(yīng)進(jìn)程可控的優(yōu)勢，早在1980年被日本科學(xué)家用于制備熒光尿嘧啶[16]。之后，光化學(xué)法也廣泛應(yīng)用于納米材料的制備，如納米銀顆粒[17]、石墨烯[18]和硫化鎘[19]等。2017年，Jin等[20]首次采用光化學(xué)法合成了N-dots，該方法將2-疊氮咪唑溶于甲醇，置于365nm的紫外燈下進(jìn)行反應(yīng)，制得了2～4nm的N-dots，產(chǎn)率高達(dá)92.7%，遠(yuǎn)高于水熱反應(yīng)的產(chǎn)率33%。光化學(xué)法制備N-dots具有產(chǎn)率高、時間短、所得樣品水溶性好的優(yōu)點，是一種極具應(yīng)用前景的合成方法。

2 N-dots的應(yīng)用

N-dots具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)、良好的生物相容性、響應(yīng)性熒光淬滅/增強(qiáng)性質(zhì)，以及易于修飾和功能化。這些特性使其在分析檢測、熒光標(biāo)記和基因與藥物投遞領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。

2.1 分析檢測

2.1.1 重金屬離子檢測

環(huán)境中的重金屬離子不僅破壞自然環(huán)境，也對人體健康造成嚴(yán)重影響[21]。盡管C-dots作為熒光探針對重金屬離子進(jìn)行檢測已經(jīng)實現(xiàn)，但是C-dots苛刻的制備條件限制了它的應(yīng)用[22]。N-dots因其制備條件溫和，表面基團(tuán)豐富且易功能化引起了研究人員廣泛關(guān)注。Wu等[23]將N-dots用于水溶液中銀離子和汞離子的檢測。銀離子和汞離子都能使N-dots的熒光迅速淬滅，但是汞離子使N-dots的熒光淬滅速度更快，兩者的檢測極限分別為0.48μM和0.63μM。熒光淬滅后往體系中加入乙二胺四乙酸，汞離子體系熒光恢復(fù)，這是由于汞離子與EDTA的親和力大于汞離子和N-dots的親和力，如圖2所示。張[24]采用聚乙烯亞胺修飾的N-dots對銅離子進(jìn)行檢測，研究發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，N-dots溶液的熒光強(qiáng)度隨著銅離子含量的增加而降低。在pH=3時，熒光淬滅效果最好，對銅離子的檢測極限為51nM。

圖2 N-dots檢測Hg2+和Ag+示意圖[23]

2.1.2 分子檢測

人體內(nèi)半胱氨酸的含量預(yù)示著人體健康水平，因此將量子點設(shè)計成熒光探針對半胱氨酸含量的檢測意義重大[25，26]。2017年，Tang等[13]將N-dots與金納米粒子設(shè)計成熒光探針，對半胱氨酸含量進(jìn)行檢測，如圖3所示。研究表明，N-dots與金納米粒子比例為4：1，體系pH=7.4時，探針效果最好，檢測范圍0.3～3μmol/L。在此基礎(chǔ)上，N-dots熒光探針成功用于血清和血漿中的半胱氨酸檢測，恢復(fù)范圍為90～106.7%?；谠撎结樍己玫募?xì)胞膜通透性和生物相容性，也成功應(yīng)用于人類肺腺癌細(xì)胞中的半胱氨酸成像。2018年，Gu等[9]將N-dots與銅離子設(shè)計成半胱氨酸探針，成功應(yīng)用于人體血清和血漿中的半胱氨酸檢測，檢測極限5.3nM，恢復(fù)范圍97.2～105.7%，且成功應(yīng)用于活體細(xì)胞中的半胱氨酸成像，在臨床診斷上具有廣闊應(yīng)用前景。

圖3 N-dots與金納米粒子作為探針檢測半胱氨酸示意圖[13]

以N-dots為基礎(chǔ)的熒光探針除了應(yīng)用在生物體內(nèi)分子檢測外，對生物體外分子探測亦具有強(qiáng)烈的選擇性和高的靈敏度。Nie等[27]首次將N-dots與聚多巴胺組裝成熒光探針并負(fù)載在濾紙條上，實現(xiàn)了溶液中對硝基苯胺的檢測。該探針能夠精準(zhǔn)識別并捕獲對硝基苯胺，當(dāng)對硝基苯胺濃度范圍在5nmol/L～1μmol/L時，探針的熒光強(qiáng)度與對硝基苯胺的濃度呈線性關(guān)系，最低的探測極限1.65nmol/L。Zou等[28]用N-dots作為熒光分子，氧化石墨烯作為控制器，構(gòu)建了以氫鍵為基礎(chǔ)的納米熒光探針，并應(yīng)用于焦磷酸鹽的檢測。基于共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)制，N-dots與氧化石墨烯結(jié)合后，N-dots熒光發(fā)生淬滅，當(dāng)焦磷酸鹽存在時，熒光效應(yīng)恢復(fù)。當(dāng)焦磷酸鹽濃度在0～400μm范圍時，熒光強(qiáng)度與焦磷酸鹽濃度呈線性關(guān)系，其最低檢測極限為8.3nM。

N-dots作為熒光探針用于分析檢測已被廣泛應(yīng)用，而作為表面增強(qiáng)拉曼散射增強(qiáng)劑對物質(zhì)進(jìn)行檢測卻少有報道。近年來，表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)因其靈敏度高、選擇性強(qiáng)、對樣品無損以及對表界面原位分析檢測的能力等優(yōu)點成為了重要的分析手段之一，在分析檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[29，30]。Lin等[31]將N-dots與銀納米離子復(fù)合并作為增強(qiáng)劑，以硅為基底，利用表面增強(qiáng)拉曼散射檢測水溶液中的孔雀石綠和龍膽紫。值得注意的是，在復(fù)合的過程中，N-dots因其表面富含氧與氮的官能團(tuán)作為還原劑使得反應(yīng)短時間內(nèi)在溫和的條件下得以完成。與此同時，N-dots也作為穩(wěn)定劑使銀納米粒子的水溶液中穩(wěn)定存在?；贜-dots修飾的銀納米粒子，表面增強(qiáng)拉曼散射能對水中的孔雀石綠和龍膽紫實驗高精度、高靈敏度探測。對于孔雀石綠，濃度在10～1000nmol/L范圍內(nèi)，散射強(qiáng)度與濃度成線性關(guān)系，最低檢測極限為2.7nM；對于龍膽紫，濃度在5～100nmol/L范圍內(nèi)，散射強(qiáng)度與濃度成線性關(guān)系，最低檢測極限為2nM。

化學(xué)發(fā)光是常見的分析檢測技術(shù)之一，與熒光探針分析相比，化學(xué)發(fā)光無需激發(fā)光，因此儀器結(jié)構(gòu)更簡單且具有靈敏度高、信噪比高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點[32，33]。Zheng等[12]將N-dots溶液注入到NaIO4-H2O2化學(xué)發(fā)光體系中，使得溶液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)了400倍。當(dāng)N-dots加入到反應(yīng)體系后，溶液顏色由無色變成了亮黃色，這表明N-dots改變了H2O2和NaIO4原來的反應(yīng)。體系的發(fā)光機(jī)理為單線態(tài)的氧與N-dots之間的能量共振轉(zhuǎn)移和N-dots輻射電子-空穴對的湮滅。Fu等[34]用N-dots與高碘酸銀鉀組合成化學(xué)發(fā)光體系，并用于阿魏酸的檢測。阿魏酸能夠有效抑制N-dots-高碘酸銀鉀系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，當(dāng)阿魏酸濃度在3x10-7～1x10-5g/mL時，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與阿魏酸濃度呈線性關(guān)系，最低檢測極限為8x10-8g/mL。這是N-dots首次基于化學(xué)發(fā)光對物質(zhì)進(jìn)行檢測，為N-dots在化學(xué)發(fā)光上的應(yīng)用提供了極具參考性價值的信息。

圖4 N-dots-NaIO4-H2O2體系化學(xué)發(fā)光機(jī)理示意圖[12]

2.2 熒光標(biāo)記

2.2.1 熒光墨水

熒光防偽技術(shù)具有成本低廉、操作方便且具有可調(diào)熒光強(qiáng)度和響應(yīng)外部刺激等特點受到人們的普遍關(guān)注，其關(guān)鍵是尋找優(yōu)異的熒光墨水[35]。N-dots具有水溶性好、耐光漂白、熒光性能好、無毒和光穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點，是一種優(yōu)秀的熒光墨水，對信息的加密和防偽具有重要意義。Chen等[8]用毛筆蘸取N-dots溶液在濾紙上書寫了N-dots和PKU字樣。該字樣在太陽光下是不可見的，只有在365nm紫外燈的照射下才能清晰可見。將書寫好字樣的濾紙浸入水中后再進(jìn)行觀察，字樣仍清晰可見，這是常規(guī)的熒光墨水所不能達(dá)到的效果。除此之外，N-dots還可對棉線、絲綢、聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色，染色后進(jìn)行充分水洗，仍能在紫外燈和熒光顯微鏡下觀察到熒光。

2.2.2 細(xì)胞成像

細(xì)胞的熒光成像是深入了解癌細(xì)胞的病變發(fā)展的一種追蹤方式，為再生療法和免疫反應(yīng)提供一定的基礎(chǔ)[36]。N-dots具有表面官能團(tuán)豐富、低毒性、光穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光可調(diào)等優(yōu)點，為其在細(xì)胞成像的應(yīng)用提供了可能。2014年，Chen等[8]成功將N-dots用于線蟲細(xì)胞成像。將線蟲置于濃度為0.5mg/mL的N-dots溶液中培養(yǎng)之后，用熒光顯微鏡在不同激發(fā)波長下可觀察到線蟲呈藍(lán)綠色、綠色和紅色熒光。2017年，Jin等[20]將小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞(RAW264.7cells)與N-dots溶液培養(yǎng)6h后，當(dāng)激發(fā)波長為770nm時，可在多光子共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)出藍(lán)色和綠色熒光，而細(xì)胞在顯微鏡下的明場像是無色的。細(xì)胞的疊加圖像表明兩個通道中的光致發(fā)光來自相同的N-dots。與此同時，細(xì)胞的光致發(fā)光成像也說明N-dots是位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并不是細(xì)胞核，這與C-dots在細(xì)胞中的分布是一致的[37]。

2.3 基因與藥物投遞

借助量子點材料，實現(xiàn)基因與藥物在生物體內(nèi)的靶向運輸和精準(zhǔn)投遞是生物醫(yī)學(xué)的重大突破之一。N-dots制備條件更溫和、更易功能化，生物相容性更好，在基因與藥物投遞方面具有應(yīng)用前景。Zhang[24]以聚乙烯亞胺修飾的N-dots為載體，成功將紅色熒光蛋白(REP)和Cy5-siRNA轉(zhuǎn)運到B16細(xì)胞中為了將聚乙烯亞胺修飾的N-dots更好應(yīng)用于基因與藥物投遞，并對實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，無論是直鏈還是支鏈聚乙烯亞胺修飾的N-dots，其濃度越高，對B16細(xì)胞的傷害也越大，但總體來說，直鏈的毒性要小。直鏈聚乙烯亞胺修飾的N-dots半抑制濃度為100μg/mL，支鏈的為25μg/mL。然而，不管是REP還是Cy5-siRNA，支鏈聚乙烯亞胺修飾的N-dots投遞效率都比直鏈的高。

3 結(jié)論與展望

N-dots作為量子點家族的新成員，對其研究工作主要集中在開發(fā)不同的制備方法以及拓寬應(yīng)用領(lǐng)域。在合成方法上，已有水熱法、微波法、光化學(xué)法三種。其中水熱法因制備工藝簡單、綠色環(huán)保被廣泛采用，但是，水熱法制備周期長限制了它的應(yīng)用；微波法方便快捷，在短時間內(nèi)即可獲得產(chǎn)物，但產(chǎn)物尺寸受功率和時間的影響，難以控制；光化學(xué)法綠色高效且反應(yīng)進(jìn)程控，應(yīng)用潛力巨大。然而，現(xiàn)有制備方法都存在前驅(qū)體單一的缺點，因此，開發(fā)不同的氮量子點前驅(qū)體以及高效的制備方法是研究人員未來的主要研究方向。在應(yīng)用方面，N-dots已被成功應(yīng)用于分析檢測、熒光標(biāo)記以及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?；贜-dots具有比C-dots更加優(yōu)異的光學(xué)特性、生物相容性和易功能化等優(yōu)點，相信在不久的將來，氮量子點在分析檢測、熒光標(biāo)記、生物醫(yī)藥、光催化等領(lǐng)域?qū)⒌玫綇V泛應(yīng)用。