朱安宏,秦 政，涂清波

(南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

槲皮素(quercetin，Qu)是一種含有多種生物活性的天然黃酮醇類化合物，在抗氧化、抑制腫瘤、抗菌、抗炎、防治糖尿病并發(fā)癥等方面具有重要作用。天然產(chǎn)物中的槲皮素濃度很低，對其進行分離與提純相對困難。近年來，分子印跡技術(shù)被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的提取[1-3]。分子印跡聚合物(MIPs)由于對模板分子具有選擇性識別的特性，受到研究者越來越多的關(guān)注。目前，采用分子印跡聚合物萃取槲皮素的研究較多[4]，但是在聚合物的吸附過程中，將目標(biāo)物從復(fù)雜體系中分離需要反復(fù)多次抽濾和離心，分離效率較低。磁性納米材料[5-8]，特別是穩(wěn)定、廉價、易制備的Fe3O4，由于具有良好的磁學(xué)性能及穩(wěn)定的物理和化學(xué)性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于各個分離領(lǐng)域，可以實現(xiàn)從復(fù)雜的基體中迅速分離目標(biāo)物。因此，磁性納米材料結(jié)合分子印跡技術(shù)的研究也越來越多[9-11]。

作者以Fe3O4磁性納米顆粒為載體、槲皮素為模板分子、丙烯酰胺(AM)為功能單體、無水乙醇為致孔劑，通過沉淀聚合法制備槲皮素磁性分子印跡聚合物(Qu/MMIPs)，采用掃描電鏡和透射電鏡對其形貌進行表征，并考察其吸附性能。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

槲皮素二水合物(98%)、丙烯酰胺(AM，98%)、2,2-偶氮二異丁腈(AIBN，98%)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA，98%)，上海阿拉丁試劑有限公司；乙二醇(EG)、聚乙二醇4000(PEG4000)、六水三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；超純水；其它試劑均為分析純。

KQ500B型超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；ME104E型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DHG-914385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DF-202B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海凌科實業(yè)發(fā)展有限公司；TGL-16C型高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；UC-1800PC型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；聚四氟乙烯不銹鋼高壓反應(yīng)釜(100 mL)，上海秋佐科學(xué)儀器有限公司；Dragon移液槍；索式提取器等。

1.2 Fe3O4磁性納米顆粒的制備

采用水熱法[12]制備Fe3O4磁性納米顆粒。取20 mL EG溶液置于聚四氟乙烯不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，加入1.02 g FeCl3·6H2O、2.82 g CH3COONa、0.086 g PEG4000，溶解，攪拌均勻后，擰緊反應(yīng)釜，密閉加熱至200 ℃，反應(yīng)12 h；取出后冷卻至室溫，依次用蒸餾水、無水乙醇超聲洗滌黑色產(chǎn)物5 min，用磁石吸住黑色產(chǎn)物，將洗液除去；反復(fù)洗滌數(shù)次后，60 ℃下真空干燥24 h，即得Fe3O4磁性納米顆粒。

1.3 槲皮素與功能單體的相互作用

1.3.1 溶液的配制

精密稱取3.38 mg(0.01 mmol)槲皮素，置于100 mL容量瓶中，加入適量乙醇，超聲使其充分溶解，冷卻至室溫后用乙醇定容至刻度，得濃度為0.1 mmol·L-1的槲皮素乙醇溶液，備用。精密稱取0.01 mmol功能單體AM、甲基丙烯酸(MAA)和乙烯基吡啶(4-VP)，分別置于100 mL容量瓶中，加入適量乙醇，超聲使其充分溶解，冷卻至室溫后用乙醇定容至刻度，得濃度均為0.1 mmol·L-1的AM、MAA和4-VP溶液，備用。

1.3.2 槲皮素與功能單體配比的選擇

分別按槲皮素與功能單體AM配比為1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置3 h使其充分作用，用紫外分光光度計測定300～500 nm范圍內(nèi)的紫外光譜，確定適宜的配比。

1.3.3 功能單體的選擇

以槲皮素為模板分子、無水乙醇為致孔劑，在不改變交聯(lián)劑和引發(fā)劑用量的條件下，分別以AM、MAA和4-VP為功能單體，按模板分子與功能單體配比為1∶2、1∶4、1∶6制備分子印跡聚合物MIP1～MIP9，測定MIP1～MIP9對槲皮素的吸附量，確定適宜的功能單體。

1.4 Qu/MMIPs、MNIPs的制備

采用沉淀聚合法制備Qu/MMIPs。準(zhǔn)確稱取0.033 8 g(0.1 mmol)槲皮素模板分子、0.021 3 g(0.3 mmol)功能單體、500 mg Fe3O4磁性納米顆粒置于裝有50 mL無水乙醇的圓底燒瓶中，超聲5 min混合均勻，室溫下反應(yīng)3 h；再加入20 mmol交聯(lián)劑EGDMA、30 mg引發(fā)劑AIBN，通入氮氣20 min后密封，80 ℃反應(yīng)24 h；以甲醇-乙酸(9∶1，體積比)混合溶液為溶劑，采用索氏提取法洗脫產(chǎn)物，直至洗脫液中無槲皮素的紫外吸收，即分子印跡聚合物中模板分子已去除，60 ℃干燥過夜，即得Qu/MMIPs。

不加槲皮素模板分子，同法制備磁性非印跡聚合物MNIPs。

1.5 Qu/MMIPs的表征

采用掃描電鏡和透射電鏡對Fe3O4磁性納米顆粒、Qu/MMIPs、MNIPs的形貌進行表征；通過分析磁滯回線，對Fe3O4磁性納米顆粒、Qu/MMIPs的磁學(xué)性能進行表征。

1.6 Qu/MMIPs的吸附性能評價

1.6.1 吸附動力學(xué)實驗

吸附動力學(xué)實驗?zāi)芊从尘酆衔锏奈搅颗c吸附時間之間的關(guān)系[7]。分別準(zhǔn)確稱取500 mg Qu/MMIPs和MNIPs置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 0.01 mg·mL-1的槲皮素乙醇溶液，放入水浴振蕩器中，常溫下分別振蕩20 min、40 min、60 min、80 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min，取混合液1 mL，微孔過濾后稀釋至5 mL，用紫外分光光度計測定其在254 nm處的吸光度，根據(jù)朗伯比爾定律確定槲皮素的平衡濃度。按下式計算聚合物對槲皮素的吸附量(Q，mg·g-1)，并繪制吸附量與吸附時間(t)的動力學(xué)吸附曲線。

式中：c0為槲皮素的初始濃度，mg·mL-1；ct為吸附平衡時槲皮素的濃度，mg·mL-1；V為槲皮素溶

液的體積，mL；m為Qu/MMIPs或MNIPs的質(zhì)量，g。

1.6.2 等溫吸附曲線的繪制

分別配制濃度(mg·mL-1)為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14的槲皮素乙醇溶液，準(zhǔn)確移取5 mL置于25 mL容量瓶中，加入50 mg Qu/MMIPs或MNIPs，用無水乙醇定容至刻度，常溫下振蕩3 h，離心，移取1 mL上清液稀釋5倍后用紫外分光光度計測定其在254 nm處的吸光度，按1.6.1方法計算Qu/MMIPs和MNIPs對槲皮素的吸附量，繪制等溫吸附曲線，并依據(jù)吸附量評價Qu/MMIPs和MNIPs的吸附性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 槲皮素和功能單體配比的選擇

槲皮素與AM相互作用的紫外光譜如圖1所示。

圖1 槲皮素與AM相互作用的紫外光譜Fig.1 UV spectra for interaction between quercetin and AM

從圖1可以看出，隨著功能單體AM占比的增加，槲皮素和功能單體AM混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度呈下降趨勢，表明槲皮素與功能單體AM間的相互作用影響了槲皮素對紫外光的吸收，而且相互作用越大，吸光度變化量(ΔA)越大。當(dāng)槲皮素與AM配比為1∶6時，相互作用趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加AM占比，對吸光度的影響較小。因此，選擇槲皮素與AM的最佳配比為1∶6。

2.2 功能單體的選擇

分子印跡聚合物MIP1～MIP9對槲皮素的吸附量見表1。

表1 分子印跡聚合物對槲皮素的吸附量

從表1可知，以MAA和4-VP為功能單體制備的分子印跡聚合物MIP4～MIP9對槲皮素的吸附量比以AM為功能單體制備的MIP1～MIP3小。主要是由于，槲皮素與AM之間的相互作用更強，兩者之間形成更多的氫鍵。當(dāng)槲皮素與AM配比為1∶6時，吸附量最大。這與配比選擇實驗結(jié)果相符。

2.3 形貌表征(圖2)

圖2 Qu/MMIPs(a)、MNIPs(b)、Fe3O4磁性納米顆粒(c)的SEM照片及Qu/MMIPs的TEM照片(d)Fig.2 SEM images of Qu/MMIPs(a),MNIPs(b),Fe3O4 magnetic nanoparticles(c),and TEM image of Qu/MMIPs(d)

從圖2可以看出，Qu/MMIPs與MNIPs都呈球狀結(jié)構(gòu)團簇在一起，粒徑基本一致；Fe3O4磁性納米顆粒粒徑均一，約為600 nm。與Fe3O4磁性納米顆粒粒徑相比，Qu/MMIPs的粒徑變大(圖2d)，表明Fe3O4磁性納米顆粒的表面包裹著分子印跡聚合物，成功制備了以Fe3O4磁性納米顆粒為核心的磁性分子印跡聚合物。

2.4 磁學(xué)性能(圖3)

圖3 Fe3O4磁性納米顆粒(a)、Qu/MMIPs(b)的磁滯回線及Qu/MMIPs在外磁場下的磁分離現(xiàn)象照片(c)Fig.3 Hysteresis loops of Fe3O4 magnetic nanoparticles(a),Qu/MMIPs(b) and photo for Qu/MMIPs magnetic separation phenomenon in external magnetic field(c)

從圖3可以看出，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒和Qu/MMIPs的磁滯回線都是可逆的，不存在磁滯現(xiàn)象，其表征物理量矯頑力以及剩磁的數(shù)值大小幾乎為零，在外磁場的作用下順磁磁化率高于一般材料，展現(xiàn)出良好的超順磁性。Fe3O4磁性納米顆粒、Qu/MMIPs的飽和磁化強度分別為80.8 emu·g-1、54.3 emu·g-1，Qu/MMIPs的飽和磁化強度低是因為，在聚合過程中Fe3O4磁性納米顆粒的表面包裹了一層分子印跡聚合物，對磁響應(yīng)產(chǎn)生了一些影響，但并不影響Qu/MMIPs的磁學(xué)性能。當(dāng)外部環(huán)境有磁場存在時，Qu/MMIPs能夠迅速聚集到靠近磁鐵的一邊，溶液變得澄清透明(圖3c)，從而可以迅速地將目標(biāo)物從復(fù)雜基體中分離。Qu/MMIPs具有良好的磁效應(yīng)，在外加磁場作用下分離效果明顯，同時該方法制備的磁性分子印跡聚合物也適用于其它化學(xué)成分的富集分離。

2.5 動力學(xué)吸附曲線(圖4)

圖4 動力學(xué)吸附曲線 Fig.4 Dynamic adsorption curves

從圖4可以看出，Qu/MMIPs和MNIPs對槲皮素的吸附量隨吸附時間的延長而增大，特別是在初期，吸附量急劇增大，表明初期時的吸附速率很快，主要是由于Qu/MMIPs和MNIPs的非特異性吸附作用所致。Qu/MMIPs的整體吸附量大于MNIPs的，這是由于，MNIPs無印跡過程，聚合物表面沒有特異性識別位點，對槲皮素的吸附屬于物理吸附，即非特異性吸附；而Qu/MMIPs的表面存在大量的印跡位點，能與槲皮素在空間結(jié)構(gòu)和官能團作用相匹配，對槲皮素特異性識別和吸附。40 min后，由于聚合物表面大量的印跡位點被槲皮素分子占據(jù)，槲皮素分子很難進入聚合物內(nèi)部，傳質(zhì)阻力增大，從而使吸附速率變慢；60 min后，吸附量基本無變化，吸附達(dá)到平衡。

2.6 等溫吸附曲線(圖5)

圖5 等溫吸附曲線Fig.5 Isothermal adsorption curves

從圖5可以看出，Qu/MMIPs、MNIPs對槲皮素的吸附量均隨濃度的增加而增大，且Qu/MMIPs的吸附量大于MNIPs的；在濃度為0.04 mg·mL-1時，MNIPs對槲皮素的吸附趨于平衡，非特異性吸附達(dá)到飽和，吸附量基本不變。除了非特異性吸附外，Qu/MMIPs的表面還有大量對槲皮素特異性識別的印跡位點，且其內(nèi)部也有很多印跡位點，又因為Qu/MMIPs內(nèi)部的傳質(zhì)阻力較大，因此，Qu/MMIPs對槲皮素的吸附量雖然逐漸增大，但吸附速率逐漸減慢直到吸附平衡。

3 結(jié)論

以Fe3O4磁性納米顆粒為載體、槲皮素為模板分子、AM為功能單體、無水乙醇為致孔劑，通過沉淀聚合法制備了Qu/MMIPs。Qu/MMIPs具有較好的磁學(xué)性能且對槲皮素模板分子具有特異選擇性，可以從復(fù)雜的天然產(chǎn)物體系中快速有效地分離槲皮素。為天然產(chǎn)物中其它化學(xué)成分的分離純化提供了一種新方法。