李彬芳 張 健

(蘇州大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123)

格隆溴銨注射液的主要成分為格隆溴銨，主要用于手術(shù)前麻醉抗毒蕈堿作用?？蓽p少唾液、氣管支氣管、咽喉分泌；減少胃液分泌的體積和游離酸度；在麻醉誘導(dǎo)和插管期間可阻斷心臟迷走神經(jīng)抑制反射。查詢各國藥典，該品種質(zhì)量標準僅收載USP藥典中，而現(xiàn)行及以往各版標準中沒有有關(guān)物質(zhì)控制方法。鑒于對注射劑質(zhì)量標準的控制，本文建立了專屬性強、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便的高效液相色譜(HPLC)檢測法，用于測定格隆溴銨注射液中有關(guān)物質(zhì)的含量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1260，安捷倫科技有限公司)，empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；SHH-220GSD-2T藥品穩(wěn)定性試驗箱(重慶永生儀器廠)；

1.2 樣品與試劑

1.2.1 樣品

格隆溴銨注射液(批號：20171002，自制)；格隆溴銨對照品(批號：R005V0，USP)；雜質(zhì)1(批號：160415，新恒創(chuàng))；雜質(zhì)2(批號：160421，新恒創(chuàng))；雜質(zhì)3(批號：2645-063A，TLC)；雜質(zhì)4(批號：FOL437，USP)；雜質(zhì)5(苯甲醛)(批號：170827，國藥化試)。

1.2.2 試劑

庚烷磺酸鈉(批號：H/0168/46，賽默飛Fisher)；無水硫酸鈉(批號：20180626，國藥化試)；濃硫酸(批號：20170912，國藥花試)；甲醇(批號：186352，賽默飛Fisher)；乙腈(批號：193731，賽默飛Fisher)；雙氧水(批號：20180418，國藥化試)；氫氧化鈉(批號：20160515，國藥化試)；鹽酸(批號：20180626，國藥化試)；氯化鈉(批號：20180828，國藥化試)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel Super-5 250 mm×4.6 mm；流動相：流動相A庚烷磺酸鈉緩沖液(0.25 g庚烷磺酸鈉溶于615 mL的1.63 g·L-1的無水硫酸鈉溶液中，加入3 mL 0.5 mol·L-1硫酸溶液，再加入甲醇150 mL，乙腈235 mL，混勻)-流動相B(乙腈)(梯度)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：215 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：75 μL；運行時間：65 min。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab. 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的配制

空白溶液(稀釋劑)：流動相A。樣品溶液：取格隆溴銨注射液作為樣品溶液。對照溶液：精密量取樣品溶液適量，加稀釋劑配制成每1 mL中約含格隆溴銨0.2 μg的對照溶液。系統(tǒng)適用性溶液：分別取格隆溴銨對照品、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4和雜質(zhì)5各適量，精密稱定，加稀釋劑溶解制備成對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，用稀釋劑溶解并稀釋制成1 mL中含格隆溴銨約0.2 mg，含雜質(zhì)1～5各約0.2 μg的系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專屬性試驗

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗

分別取系統(tǒng)適用性溶液、稀釋劑、樣品溶液和對照溶液各75 μL注入色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖(圖1)。格隆溴銨與雜質(zhì)5之間分離度大于4.5，各色譜峰之間最小分離度為4.6，對照溶液峰面積RSD為1.5，主成分和各雜質(zhì)的峰純度角均小于純度閾值。稀釋劑對各雜質(zhì)無干擾，加入雜質(zhì)的供試品混合溶液中各色譜峰能達到良好分離，說明本方法系統(tǒng)適用良好。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖Fig. 1 Chromatogram of system Suitability solution

2.3.2 破壞試驗

考察樣品溶液在酸、堿、氧化、高溫、光照條件下的降解情況，以及各破壞條件下雜質(zhì)與主成分的分離情況，各破壞樣品溶液的配制具體如下：

未破壞溶液：取格隆溴銨注射液作為未破壞溶液；

酸降解樣品溶液：取格隆溴銨注射液2支，混合，加入1 mol·L-1鹽酸0.1 mL，室溫下放置9天后，加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液0.1 mL中和，即得。同法配制酸降解空白溶液。

堿降解樣品溶液：取格隆溴銨注射液2支，混合，加入1 mol/L氫氧化鈉0.1 mL，立即加入1 mol·L-1鹽酸溶液0.1 mL中和，即得。同法配制堿降解空白溶液。

氧化降解樣品溶液：取格隆溴銨注射液2支，混合，加入3%雙氧水0.2 mL，置60 ℃水浴加熱1 h，即得。同法配制氧化降解空白溶液。

高溫降解樣品溶液：取格隆溴銨注射液，置60 ℃恒溫箱中放置10天，取出放冷至室溫后即得。同法配制高溫降解空白溶液。

光降解樣品溶液：取格隆溴銨注射液，放置在光照強度為(5 000±500)lux的光照箱內(nèi)10天，取出，即得。同法配制光降解空白溶液。

取上述溶液及稀釋劑分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果，格隆溴銨注射液在酸、堿及高溫降解條件下總雜質(zhì)分別為2.96%、2.58%、1.12%，相對于初始總雜質(zhì)(0.85%)有明顯增加，說明本品在酸、堿和高溫條件下不穩(wěn)定，在光照和氧化條件下，總雜質(zhì)分別為0.79%、0.92%，與初始值相當，說明本品在光照和氧化條件下穩(wěn)定。在各破壞條件下，主要降解雜質(zhì)均是雜質(zhì)1；格隆溴銨與相鄰雜質(zhì)、已知雜質(zhì)與相鄰雜質(zhì)能達到良好的分離度，格隆溴銨和主要降解雜質(zhì)的純度角均小于純度閾值；各降解條件下物料平衡率均在90%～110%之間。本方法有較強的專屬性。

2.4 溶液穩(wěn)定性

按“2.2”項方法配制的對照溶液、樣品溶液、系統(tǒng)適用性溶液，于室溫下放置考察溶液穩(wěn)定性，分別于0、2、4、8、12、24 h時間點進樣分析，對照溶液24 h內(nèi)，峰面積回收率(測定時間點的峰面積與0 h峰面積比值)在95%～105%；供試品溶液24 h內(nèi)，最大未知雜質(zhì)、總雜質(zhì)與0 h的差值均不過0.02%，且沒有新雜質(zhì)產(chǎn)生；系統(tǒng)適用性溶液24 h內(nèi)，各成分峰面積回收率(測定時間點的峰面積與0 h峰面積比值)均在95%～105%。說明對照溶液、供試品溶液及系統(tǒng)適用性溶液在室溫條件下24 h穩(wěn)定。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取2.2項下雜質(zhì)1，2，3，4，5及格隆溴銨對照品貯備液，用稀釋劑稀釋制成一系列含各雜質(zhì)及格隆溴銨對照品的溶液，按色譜條件下依次進樣測定，記錄峰面積，以峰面積對濃度進行線性回歸。結(jié)果見表2。校正因子計算公式為：校正因子=格隆溴銨斜率/各雜質(zhì)斜率。

表2 對照品線性關(guān)系及校正因子測定結(jié)果Tab. 2 The result of reference substance Linearity and Correction factor

2.6 檢測限和定量限

2.6.1 定量限

取格隆溴銨、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4和雜質(zhì)5的線性貯備液(見“2.5”項)，用稀釋劑逐步稀釋，當信噪比約為10～20時，即得到定量限溶液，上述各組分的定量限依次為0.042、0.008、0.003、0.02、0.014 L、0.021 μg·mL-1。

2.6.2 檢測限

取格隆溴銨、雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)3、雜質(zhì)4和雜質(zhì)5的線性貯備液(見“2.5”項)，用稀釋劑逐步稀釋，當信噪比約為3～5時，即得到檢測限溶液，上述各組分的檢測限依次為0.017、0.003、0.001、0.008、0.005、0.008 μg·mL-1。

各組分的定量限溶液連續(xù)進樣6次，峰面積RSD均不超過10%。定量限和檢測限濃度均不超過供試品濃度的0.02%，方法靈敏度良好。

2.7 精密度

從同一批均質(zhì)樣品中取6份，用測定6次的結(jié)果進行評價，采用加校正因子的主成分自身對照法進行結(jié)果計算。取本品適量，照“2.2”項下方法平行配制6份供試品溶液及相應(yīng)的對照溶液。結(jié)果見表3，6份供試品中各雜質(zhì)含量RSD均不超過10%，總雜質(zhì)含量RSD為1.42%，說明該分析方法的精密度良好。

表3 精密度

2.8 準確度

用0.9%氯化鈉溶液溶解格隆溴銨原料儲備液，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.8，向該溶液加入雜質(zhì)限度濃度的50%～150%雜質(zhì)對照品(最終測定溶液中格隆溴銨濃度為0.2 mg·mL-1)，扣除空白樣品中雜質(zhì)含量后，以測得量與加入量的比值計算雜質(zhì)回收率。結(jié)果(如表4所示)表明：雜質(zhì)1～5各級別回收率均在99.6%～102.3%之間，其RSD均小于5.0%，符合可接受標準，說明該有關(guān)物質(zhì)分析方法具有良好的準確度。

表4 準確度Tab. 4 Result of Accuracy

2.9 耐用性

耐用性試驗分別對柱溫(25、35 ℃)、流速(0.9、1.1 mL·min-1)、硫酸加入量(2.7 mL、3.3 mL)和色譜柱(ACE-super C18、Titank C18)進行了研究。結(jié)果見表5。結(jié)果顯示微小改變后各雜質(zhì)峰之間、雜質(zhì)峰與主峰之間均有較好分離，對同一批產(chǎn)品檢測結(jié)果一致，結(jié)果表明方法耐用性良好。

表5 耐用性Tab. 5 Result of Robustness

2.10 有關(guān)物質(zhì)測定

用上述已驗證完成的方法檢測自制的三批格隆溴銨注射液穩(wěn)定性考察樣品，按加校正因子的主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量，各已知雜質(zhì)、最大未知雜質(zhì)及總雜質(zhì)均符合擬定的質(zhì)量標準，結(jié)果見表6。

表6 三批樣品測定結(jié)果Tab. 6 Results of three batches test sample

3 討論

查詢各藥典，暫無格隆溴銨注射液有關(guān)物質(zhì)方法收載。故參考歐洲藥典(EP)9.0，USP40版、中國藥典2015版格隆溴銨原料標準，在此基礎(chǔ)上進行比較優(yōu)化，并作進一步研究與驗證，確定EP 9.0方法更有利于格隆溴銨注射液有關(guān)物質(zhì)檢出；通過對已知雜質(zhì)，及樣品破壞中主要雜質(zhì)紫外吸收波長的掃描，雜質(zhì)均在210 nm附近有紫外吸收，最終選擇和EP 9.0中檢測波長一致215 nm。本方法流動相體系中采用的離子對試劑，為保證基線平穩(wěn)，需選擇規(guī)格較高的化試，必要時可加預(yù)柱，以保護色譜柱。通過方法學(xué)驗證，結(jié)果表明，采用本法測定格隆溴銨注射液的有關(guān)物質(zhì)，操作簡便，結(jié)果準確可靠，重現(xiàn)性好，專屬性強，可用于格隆溴銨注射液的有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。