劉 巖， 李雙標(biāo)， 許 華， 張志堅(jiān)， 李勝水， 張全樂， 張鳳梅

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。相關(guān)研究顯示，CRC的發(fā)病率與高動(dòng)物蛋白飲食相關(guān)[2-3]。同時(shí)近年來的研究顯示環(huán)境因素在CRC發(fā)病中同樣發(fā)揮重要作用[4]。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因、多步驟的病理過程。首先病變起源于正常結(jié)直腸上皮，逐漸發(fā)展成為腺瘤等癌前病變，腺瘤可進(jìn)一步發(fā)展為具有轉(zhuǎn)移潛能的侵襲性結(jié)直腸癌。

CRC的總病死率約為50%，診斷時(shí)的手術(shù)分期是預(yù)測(cè)患者預(yù)后的最重要因素，Ⅰ期患者的5年生存率超過90%，而Ⅳ期患者的5年生存率則低于10%[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及二代測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，眾多與腫瘤預(yù)后有關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因在腫瘤組織及正常組織中往往呈現(xiàn)差異表達(dá)，并與患者的預(yù)后有關(guān)。

Snail基因定位于人20號(hào)染色體q13.13區(qū)，其編碼蛋白為一種鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子，其生物學(xué)功能與中胚層、外胚層細(xì)胞內(nèi)某些基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。該基因編碼的核蛋白被認(rèn)為是胚胎形成的關(guān)鍵蛋白。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)Snail在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，然而Snail在結(jié)直腸癌中的研究鮮有報(bào)道，其具體生物學(xué)功能不明。

1 資料與方法

1.1 Snail表達(dá)水平分析 檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，對(duì)比各組織及實(shí)體腫瘤組織中Snail基因的表達(dá)水平。檢索條件為“結(jié)直腸癌”“結(jié)腸癌”“直腸癌” “snail”，物種為人類。同時(shí)比較snail基因在結(jié)直腸癌患者癌組織和癌旁組織中是否存在表達(dá)差異。存在差異表達(dá)的條件為snail基因mRNA上調(diào)或下調(diào)表達(dá)超過 2 倍（|Log2FC|>1），且P<0.05[6]。

1.2 Snail蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建snail蛋白相互作用的蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)，snail蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.7，相互作用來源為共表達(dá)、基因功能和比鄰關(guān)系[7]。

1.3 Snail基因共表達(dá)及生存分析 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，依據(jù)與snail基因共表達(dá)關(guān)系，對(duì)與snail基因存在相關(guān)性的基因進(jìn)行聚類。同時(shí)選取正相關(guān)和負(fù)相關(guān)表達(dá)最為明顯的2個(gè)基因進(jìn)行分析，計(jì)算spearman相關(guān)系數(shù)；根據(jù)snail基因mRNA在結(jié)直腸癌患者癌組織中表達(dá)的中位數(shù)，分為高、低表達(dá)組，繪制生存分析曲線，并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)比較高、低表達(dá)組患者總生存期（OS）和無疾病進(jìn)展生存期（DFS）是否存在差異。

1.4 免疫組化檢測(cè)Snail蛋白表達(dá) 選取河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者69例，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中Snail蛋白表達(dá)水平，分析Snail蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Snail蛋白表達(dá)按試劑盒操作說明進(jìn)行。Snail蛋白表達(dá)高低判定標(biāo)準(zhǔn)：在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野下進(jìn)行觀察。染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色(0分)、淺黃(1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分)；陽性細(xì)胞比例評(píng)分：陽性<10%(0分)；陽性10%～25%(1分)；陽性26%～50%(2分)；陽性51%～75%(3分)及陽性>75%(4分)。總體評(píng)分值=陽性細(xì)胞比例評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分；最終評(píng)判：<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用stata12.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例表示，比較用卡方檢驗(yàn)，采用log-rank檢驗(yàn)比較高、低表達(dá)組的生存期，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail基因表達(dá) Snail蛋白在膀胱、甲狀腺和脂肪組織中表達(dá)水平較高，而在胸腺和淋巴細(xì)胞中表達(dá)水平較低（圖1A）；Snail基因在各種腫瘤組織中的表達(dá)差異并不明顯（圖1B）；在結(jié)直腸癌患者中，癌組織Snail基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織（圖1C）。但Snail表達(dá)水平在不同臨床分期結(jié)直腸癌患者中差異不顯著(P>0.05，圖1D）。

圖1 Snail基因在結(jié)直腸癌和其他腫瘤中的表達(dá)

2.2 Snail蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI） 利用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)Snail蛋白相關(guān)的基因編碼蛋白進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。PPI網(wǎng)絡(luò)中與Snail蛋白相互作用最為緊密的蛋白10個(gè)（圖2）。各個(gè)蛋白間相互租用關(guān)系的緊密程度采用連線表示，兩兩蛋白間連線越粗表示相互作用關(guān)系越緊密。PPI網(wǎng)絡(luò)中相互作用關(guān)系共55個(gè)，區(qū)域聚類指數(shù)為1.0，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集顯著（P<0.05）。

2.3 Snail基因共表達(dá)分析 TCGA數(shù)據(jù)庫中，與Snail表達(dá)呈正相關(guān)最顯著的基因?yàn)镻DGFB基因（r=0.625,P<0.05），與Snail表達(dá)呈負(fù)相關(guān)最顯著的基因?yàn)镾LC44A4(r=–0.48,P<0.05)，見圖3、4。

2.4 Snail生物學(xué)功能富集 Snail及其相關(guān)基因生物學(xué)過程主要富集于組蛋白H4脫乙酰化、受體生物合成過程的正調(diào)控、受體生物合成過程的正調(diào)控等；細(xì)胞成分主要富集于ESC/E（Z）復(fù)合體、Sin3絡(luò)合物、轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物等；分子功能主要富集于NAD依賴性組蛋白脫乙酰酶活性（H3-K14特異性）、組蛋白脫乙酰酶活性和啟動(dòng)子特異性染色質(zhì)結(jié)合等，見表1。

圖2 與Snail蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)（PPI）

圖3 Snail基因共表達(dá)分析熱圖

圖4 Snail共表達(dá)正負(fù)相關(guān)基因散點(diǎn)圖

表1 Snail及相關(guān)基因GO功能富集

2.5 KEGG信號(hào)通路 Snail基因相關(guān)信號(hào)通路主要富集于腫瘤相關(guān)信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路和結(jié)直腸癌相關(guān)信號(hào)通路等（圖5，表2）

2.6 生存分析依據(jù) 預(yù)后分析提示SnailmRNA高表達(dá)組的OS低于低表達(dá)組（HR=1.6,P<0.05圖6A）；而高、低表達(dá)組的DFS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖 6B）。

2.7 Snail蛋白表達(dá) 免疫組化顯示Snail蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞膜和細(xì)胞核，呈棕褐色顆粒，圖7。Snail蛋白高表達(dá)結(jié)直腸癌患者的OS低于低表達(dá)患者，圖8。

圖5 Snail及相關(guān)基因KEGG信號(hào)通路氣泡圖

表2 Snail及相關(guān)基因KEGG信號(hào)通路

圖6 Snail基因mRNA表達(dá)與結(jié)直腸癌患者生存情況之間的關(guān)系

圖7 Snail蛋白表達(dá)免疫組化分析（×200，×400）

圖8 Snail蛋白高、低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后關(guān)系

2.8 Snail蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Snail蛋白在結(jié)直腸癌患者癌組織中的高表達(dá)率為59.2%（41/69）。Snail蛋白高表達(dá)者腫瘤分化程度較低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管侵犯率較高且Dukes分期較晚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 Snail蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

1987年Boulay等[8]通過對(duì)果蠅研究發(fā)現(xiàn)并首先描述了Snail基因。后來證明了Snail是中胚層形成的必要條件[9]。Snail被分離鑒定出來的20年時(shí)間里，Snail家族50多個(gè)家庭成員被先后發(fā)現(xiàn)，并具有類似的生物學(xué)功能[10]。Snail基因最顯著的生物學(xué)功能為誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）表型改變[11-12]。Snail誘導(dǎo)的EMT將上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有遷移特性的間充質(zhì)細(xì)胞，這些遷移特性有助于胚胎發(fā)育過程中許多組織的形成和上皮腫瘤侵襲特性的獲得。Snail誘發(fā)的EMT部分是由于E-Cadherin轉(zhuǎn)錄受到直接抑制所引發(fā)的。由于E-Cadherin在腫瘤中的缺失被認(rèn)為是一種預(yù)后不良指標(biāo)。E-Cadherin表達(dá)缺失或被抑制被認(rèn)為是惡性表型的重要標(biāo)志，同時(shí)也是抗侵襲藥物的潛在研究靶點(diǎn)。然而，有些細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過程不需要完全的EMT，例如果蠅和無性脊椎動(dòng)物胚胎（缺乏羊膜的脊椎動(dòng)物胚胎，如兩棲動(dòng)物和魚類胚胎）的中胚層形成[13-14]。然而，最近的證據(jù)顯示Snail基因也可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移參與上述過程[15]。因此，Snail基因的主要功能可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附而不是誘導(dǎo)EMT。在這種情況下，EMT只是這些轉(zhuǎn)錄因子用來允許細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的機(jī)制之一。

近年來的研究顯示Snail基因在人類多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)明顯的差異表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等[16-18]。Hu等[16]采用免疫組化檢測(cè)了89例乳腺癌和50例乳腺良性腫瘤組織中Snail的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Snail蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有關(guān)。Wang等[17]在研究Snail蛋白在前列腺癌中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Snail蛋白在前列腺癌中表達(dá)水平明顯上調(diào)，高表達(dá)患者的OS及DFS明顯降低，提示Snail蛋白是前列腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。

本研究首先采用生物信息分析方法探討Snail基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，并分析其高低表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。研究證實(shí)Snail基因在結(jié)直腸癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與患者的生存期縮短有關(guān)。同時(shí)，進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)證實(shí)Snail蛋白高達(dá)者腫瘤分化程度較低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管侵犯率較高且Dukes分期較晚，與生物信息分析結(jié)果基本一致。

目前，Snail基因被認(rèn)為可能參與了多種實(shí)體腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過程，其機(jī)制主要與誘導(dǎo)EMT有關(guān)。隨著更多關(guān)于Snail基因調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究的開展，Snail可能成為原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的重要治療靶點(diǎn)。