曾 煜 李 賀 逯金瑤 向晨旭 李 翔 付昌健 李 立* 邢曉瑩*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊，050024；3.湖南省野生動物救護(hù)繁殖中心，長沙，410116)

性別鑒定對研究鳥類(Aves)種群動態(tài)、群落結(jié)構(gòu)、棲息地的利用以及行為都具有重要作用[1]。全世界現(xiàn)存約11 000種鳥類[2]，其中約50%是單態(tài)型[3]，雌雄間形態(tài)上難以區(qū)分。已有多種方法用于單態(tài)型鳥類的性別鑒定，如形態(tài)測量、鳴聲分析、解剖、泄殖腔檢測和腹腔鏡檢測、細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)方法鑒定等[4]。上述方法中，細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)難以在野外快速鑒定鳥類性別，鳴聲分析在非繁殖期難以使用，解剖、泄殖腔檢測和腹腔鏡檢測等方法操作煩瑣或?qū)B體造成傷害[4]。

利用形態(tài)測量進(jìn)行性別鑒定是鳥類研究的重要工作，國內(nèi)外利用形態(tài)參數(shù)鑒定性別的研究較為常見。鳥類的雌雄形態(tài)可能具有二態(tài)性，如紅尾鵟(Buteojamaicensis)雌雄間在體重、嘴峰長、尾長上存在顯著差異[5]；雄性灰伯勞(Laniusexcubitor)的翅長、尾長均顯著大于雌性[6]；發(fā)冠卷尾(Dicrurushottentottus)的喙粗、頭喙長、跗蹠長、翅長、尾長、發(fā)羽數(shù)和第一根發(fā)羽長均存在差異，且雄性顯著大于雌性[7]；紅腳鰹鳥(Sulasula)雌性體重大于雄性[8]。此外，羽色與飾羽斑塊大小在雌雄間也可能存在二態(tài)性，雄性牛背鷺(Bubulcusibis)頭部、肩部以及胸部飾羽斑塊顯著大于雌性[9]；大嘴烏鴉(Corvusmacrorhynchos)具有彩虹光澤的羽毛，雄性比雌性更鮮艷[10]。自然選擇和性選擇對兩性影響的不同，被認(rèn)為導(dǎo)致了鳥類在形態(tài)上出現(xiàn)性二態(tài)，例如雌雄同域分布，在自然選擇壓力下為擴(kuò)展生態(tài)位同時(shí)減小兩性食物競爭，雌雄喙出現(xiàn)性二態(tài)；雌性對雄性尾長的選擇偏好，導(dǎo)致雄性尾羽長于雌性[11]。研究鳥類形態(tài)是否存在性二態(tài)時(shí)，分子生物學(xué)結(jié)果是鑒定性別的重要依據(jù)，因?yàn)镈NA 分子技術(shù)逐漸成熟，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性較高[3]。鳥類性染色體上存在螺旋蛋白結(jié)合基因(CHD)，雄鳥只有CHD-Z基因，而雌鳥有兩個(gè)同源拷貝即CHD-Z和CHD-W基因，因此進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)Z染色體和W染色體上的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小存在差異：有1個(gè)條帶的為雄性個(gè)體，有2條大小不同條帶的為雌性個(gè)體[3，12-14]。

白頭鵯(Pycnonotussinensis)隸屬于雀形目(Passeriformes)，鵯科(Pycnonotidae)，鵯屬，廣泛分布于我國南方，包括指名亞種Py.s.sinensis、兩廣亞種Py.s.hainanus和臺灣亞種Py.s.formosae。領(lǐng)雀嘴鵯(Spizixossemitorques)隸屬于鵯科，雀嘴鵯屬，我國分布2個(gè)亞種，指名亞種Sp.e.semitorques分布于南方各省，臺灣亞種Sp.e.cinereicapillus僅分布于臺灣島[15]。白頭鵯和領(lǐng)雀嘴鵯的指名亞種在形態(tài)上均難以區(qū)分性別，野外觀察發(fā)現(xiàn)兩種鵯是本研究地點(diǎn)鵯科鳥類的優(yōu)勢種，繁殖期雄性間都存在種內(nèi)爭斗[16-17]，故推測二者極可能都存在較強(qiáng)烈的性選擇。而無論是性間選擇還是性內(nèi)選擇都可導(dǎo)致雌雄個(gè)體間產(chǎn)生形態(tài)差異，例如雄性斗爭或雌鳥偏好或許會促使體重、體長等參數(shù)在雌雄間產(chǎn)生性二態(tài)[18-19]。此外，親緣關(guān)系也被證實(shí)與是否存在性二態(tài)有關(guān)，Székely等[20]研究發(fā)現(xiàn)同科鳥類雌雄形態(tài)差異可能相同。對鵯科鳥類的表型與基因分析發(fā)現(xiàn)我國分布的雀嘴鵯屬具有分類獨(dú)特性，而獨(dú)立分支成屬[21-22]。因此對這兩種鵯科不同屬鳥類雌雄差異性進(jìn)行對比，也可為鵯科鳥種親緣關(guān)系提供參考。

已有研究發(fā)現(xiàn)白頭鵯指名亞種雄鳥的翅長、尾長、跗蹠長、喙峰長、喙高和體長顯著大于雌鳥，兩廣亞種雄鳥的翅長、尾長、跗蹠長、喙峰長和喙寬顯著大于雌鳥[23]。但這些指標(biāo)均是測量標(biāo)本，無體重、飛羽與翅膀面積等重要指標(biāo)，而由于自然選擇壓力的不同也可導(dǎo)致不同種群性二態(tài)出現(xiàn)差異。白頭鵯指名亞種的枕部白色斑塊被認(rèn)為可區(qū)分雌雄個(gè)體，但缺乏量化證據(jù)，已有研究僅對斑塊的寬窄或大小進(jìn)行數(shù)量等級劃分[23-25]，缺乏量化分析。為鑒別白頭鵯與領(lǐng)雀嘴鵯指名亞種雌雄形態(tài)是否存在差異，本研究以DNA 分子技術(shù)為基礎(chǔ)，通過測量形態(tài)指標(biāo)，對白頭鵯和領(lǐng)雀嘴鵯進(jìn)行性別鑒定，并對比兩種鵯科鳥類的性二態(tài)是否不同。

1 材料與方法

1.1 個(gè)體捕捉與形態(tài)參數(shù)測量

2018年4月，于湖南長沙(112°45′E，28°1′N)在白頭鵯與領(lǐng)雀嘴鵯活動區(qū)域架設(shè)霧網(wǎng)進(jìn)行捕捉。測量白頭鵯與領(lǐng)雀嘴鵯的各形態(tài)學(xué)參數(shù)，包括體重(body mass)、跗蹠長(tarsometatarsus length)、翅長(wing length)、飛羽長(remiges 從外側(cè)第一飛羽至第九飛羽)、尾長(tail length)、體長(body length)、喙峰長(beak peak length)、嘴裂(gape length)、喙寬(beak width)、喙高(beak height)。將白頭鵯頭部固定于有標(biāo)尺的木板上，頸部完全貼合避免拍照角度造成影響，翅膀完全展開，用手機(jī)相機(jī)(Samsung S8，Korea)垂直拍攝(避免角度不同對結(jié)果造成影響)其枕部與翅膀，用于枕部白色斑塊與翅膀面積的計(jì)算。

1.2 分子生物學(xué)鑒定

血液DNA提?。河妹?xì)管從白頭鵯與領(lǐng)雀嘴鵯翅下靜脈采集新鮮血液，冷凍保存(-40°C)。取250 μL血液樣本利用試劑盒提取DNA(康為世紀(jì)，Cat：CW2087)。按照試劑盒上標(biāo)注的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其組分構(gòu)成為：12.5 μL DNA聚合酶(Premix ExTaq)，2 μL模板(DNA-templated)，引物(Primer)SexF與引物SexR各1 μL，添加滅菌去離子水(ddH2O)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下變性30 s，54 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；在72 ℃下補(bǔ)齊10 min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條件為120 V，20 min。電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增基因長度約為190—250 bp，CHD-W的擴(kuò)增片段小于CHD-Z，電泳圖顯示1個(gè)條帶的為雄性個(gè)體，2個(gè)條帶的為雌性個(gè)體。反應(yīng)體系的引物由Invitrogen公司合成，序列為：

SexF：5′-CGTCAATTTCCATTTCAGGTAAG-3′

SexR：5′-TTATTGATCCATCAAGTCTC-3′

1.3 面積分析

用ImageJ(v 1.80)軟件測量白頭鵯翅膀面積與枕部白色斑塊面積。首先將圖片轉(zhuǎn)換為8-bit，通過已經(jīng)設(shè)置好的標(biāo)尺(5 cm)，賦值，在翅膀照片上繪制出翅膀邊緣輪廓并計(jì)算面積。測量枕部白色斑塊面積時(shí)首先將圖片轉(zhuǎn)變?yōu)?-bit，通過已經(jīng)設(shè)置好的標(biāo)尺(2 cm)，賦值。提取白頭鵯頭部與枕部部分邊緣(因嘴基部有白色羽毛影響結(jié)果而不提取鳥喙部分)，調(diào)整明亮程度，將其最小值設(shè)定為15，致白頭鵯枕部黑白羽毛邊際分明，將枕部白色斑塊完全覆蓋后選中，繪制出邊界輪廓，測量白色斑塊的面積(圖1)。對存在黑色雜羽或黑色斑塊的枕部羽毛，將所有白色羽毛部分面積相加作為個(gè)體的白色斑塊面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS(v 20.0)軟件的單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)測量參數(shù)正態(tài)性，結(jié)果均為正態(tài)分布，因此將所有形態(tài)參數(shù)進(jìn)行單變量ANOVA方差分析來比較雌雄間的形態(tài)差異。對具有顯著性差異的指標(biāo)構(gòu)建判別方程。首先觀察數(shù)據(jù)分布有無特別的離異點(diǎn)、缺失值和不合理的分布，從而可以用該數(shù)據(jù)做接下來的判別分析。自變量為尾長、枕部白色斑塊面積與翅長，類別變量為雌雄，進(jìn)行Fisher判別分析，按照Wilks統(tǒng)計(jì)量最小的原則分析，通過會判參數(shù)得出其準(zhǔn)確性。對比單變量與多變量準(zhǔn)確性，得出鑒定性別的最佳參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

對捕捉到的26只白頭鵯與12只領(lǐng)雀嘴鵯進(jìn)行DNA性別鑒定，結(jié)果為白頭鵯雄性16只，雌性10只；領(lǐng)雀嘴鵯雄性5只，雌性7只(圖2)。白頭鵯雄性的尾長與枕部白色斑塊面積顯著大于雌性(P<0.05)，翅長差異接近顯著水平(P=0.081)(表1，圖3—圖5)。對具有顯著性差異與接近顯著水平差異指標(biāo)進(jìn)行判別分析，結(jié)果表明在單變量中枕部白色斑塊面積作為白頭鵯性別鑒定指標(biāo)的準(zhǔn)確性最高為70.6%；多變量指標(biāo)中枕部白色斑塊面積結(jié)合尾長與翅長，準(zhǔn)確性最高為82.4%(表2)。

白頭鵯的其他參數(shù)，作為身體狀態(tài)與雄性競爭的指標(biāo)，即體重、跗蹠長和體長在雌雄之間差異不顯著(P>0.05)；作為飛行能力相關(guān)參數(shù)，即飛羽與翅膀面積在雌雄之間差異不顯著(P>0.05)；作為與捕食相關(guān)參數(shù)，即喙峰長，嘴裂，喙寬，喙高在雌雄之間差異不顯著(P>0.05)(表1)。領(lǐng)雀嘴鵯所有形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)，在雌雄間均無顯著性差異(表3)。

圖1 白頭鵯枕部白色斑塊面積測量Fig.1 Area size measurement of white nape feather in Pycnonotus sinensis

表1 白頭鵯雌雄間形態(tài)參數(shù)的單因素ANOVA方差檢驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表1

表2 判別函數(shù)對白頭鵯性別判別的準(zhǔn)確性

表3 領(lǐng)雀嘴鵯雌雄間形態(tài)參數(shù)的單因素ANOVA方差檢驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3

圖2 DNA性別鑒定結(jié)果Fig.2 DNA test result of sex identification 注：編號1—26為白頭鵯，編號27—38為領(lǐng)雀嘴鵯 Note：Number 1-26 are Pycnonotus sinensis，number 27-38 are Spizixos semitorques

圖3 白頭鵯尾長雌雄對比Fig.3 Comparison of tail length between male and female Pycnonotus sinensis

圖4 白頭鵯枕部白色斑塊面積雌雄對比Fig.4 Comparison of area size of white nape feather between male and female Pycnonotus sinensis

圖5 白頭鵯翅長雌雄對比Fig.5 Comparison of wing length between male and female Pycnonotus sinensis

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過擴(kuò)增鳥類性染色體的螺旋蛋白結(jié)合基因(CHD)鑒定白頭鵯與領(lǐng)雀嘴鵯性別，擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定，電泳結(jié)果清晰、準(zhǔn)確，擴(kuò)增成功率高。蘇倡等[14]對擴(kuò)增該基因鑒定雀形目鳥類性別準(zhǔn)確性的研究中指出，根據(jù)所用引物不同，鑒定鳥類性別準(zhǔn)確率存在差異，錯(cuò)誤主要來自CHD-W或CHD-Z基因其中的一個(gè)擴(kuò)增失敗，未出現(xiàn)假陽性擴(kuò)增的現(xiàn)象。因此可初步斷定，本次實(shí)驗(yàn)所使用引物的DNA鑒別準(zhǔn)確性高，但該引物鑒定鳥類性別準(zhǔn)確率仍需后續(xù)檢驗(yàn)。

研究發(fā)現(xiàn)白頭鵯指名亞種雌雄個(gè)體在尾長和枕部斑塊面積存在顯著差異，翅長差異接近顯著水平，上述參數(shù)均雄性大于雌性，可作為野外迅速鑒定性別的依據(jù)。領(lǐng)雀嘴鵯指名亞種在所有測量的形態(tài)參數(shù)上均不存在性二態(tài)。楊曉菁等[23]研究表明，白頭鵯指名亞種雌雄間的尾長、翅長存在顯著差異，與本文結(jié)果一致。鳥類的尾羽具有平衡身體的作用，野外觀察發(fā)現(xiàn)，白頭鵯雄性爭斗時(shí)會展開尾羽平衡身體，因此尾長更長的雄性個(gè)體在爭斗中可能更具有優(yōu)勢，進(jìn)而在雌雄間產(chǎn)生性二態(tài)。性選擇對于雌雄二態(tài)性的影響已在多物種中得到證實(shí)[10，19，26-27]，由于雌鳥對雄鳥的尾長與翅長具有選擇偏好，因此尾長與翅長較大的雄性交配成功率更高，進(jìn)而導(dǎo)致雌雄尾長與翅長產(chǎn)生性二態(tài)[6，28-29]。此外尾長、翅長與鳥的飛行能力呈正相關(guān)，有助于鳥類捕食與筑巢等，因此擁有更強(qiáng)的育雛能力[30]，繁殖期雄性白頭鵯參與育雛[17]，雌性白頭鵯可能偏好長尾羽的雄性。因此推測性選擇可能導(dǎo)致白頭鵯兩性在形態(tài)上的差異。

白頭鵯枕部白色斑塊面積或許受到性選擇壓力。首先，我們在野外多次觀察到白頭鵯繁殖期鳴唱或打斗時(shí)枕部白色羽毛會展開，推測作為雄鳥的第二性征展示給其他雄鳥及雌鳥。在許多鳥類中雌性表現(xiàn)出對雄性飾羽的偏好[26-27，29]，因?yàn)轱椨鹂梢詮囊欢ǔ潭壬戏从成眢w健康狀況，雌性石雀(Petroniapetronia)對雄性尾部白色羽毛斑塊具有選擇偏好[30]；雌性牛背鷺對雄性的頭部、背部和肩部飾羽都具有性選擇偏好[31]；在對暗眼燈草鹀(Juncohyemalis)的研究中，雄性尾羽外部白色羽毛斑塊明顯大于雌性，被認(rèn)為受到雌鳥的選擇偏好[32]。其次，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)白頭鵯雌雄個(gè)體間的枕部白色斑塊面積大小主要分布范圍(第一四分位數(shù)至第三四分位數(shù))相似，即均集中在約1 cm2的范圍內(nèi)(雌性0.952—1.933 cm2，雄性1.889—2.772 cm2)，但白色斑塊面積的總變化范圍雄性遠(yuǎn)大于雌性(雌性0.935—1.941 cm2，雄性1.378—3.757 cm2)。這說明在繁殖前期或繁殖期雄性的頭部白色羽化傾向更明顯，即集群越冬的白頭鵯雄鳥之間，繁殖狀態(tài)的不同步或許導(dǎo)致個(gè)體間白色斑塊面積大小不同?；蛟S是白頭鵯以集群方式越冬，以一雄一雌方式繁殖的一種適應(yīng)性策略，因?yàn)樵谠蕉诎最^鵯集大群，而領(lǐng)雀嘴鵯集小群[33-34]，推測在我們?nèi)訒r(shí)白頭鵯集群中已出現(xiàn)處于繁殖前期的個(gè)體，可能因配偶選擇而開始出現(xiàn)雌雄差異。楊曉菁等[23]研究也表明，白頭鵯枕部白色斑塊大小存在季節(jié)性差異，在繁殖季節(jié)達(dá)到最大，符合飾羽假說。但是，飾羽的大小可能與鳥類個(gè)體的年齡有關(guān)[32]，鄭作新等[24]認(rèn)為白頭鵯枕部近全白的個(gè)體為“老鳥”，本研究未排除年齡因素對結(jié)果造成的影響，白頭鵯枕部白色斑塊面積大小是否隨年齡增加而變化仍需進(jìn)一步確認(rèn)。

白頭鵯其他參數(shù)，包括體重、體長、跗蹠長、飛羽(第一飛羽，第二飛羽，第三飛羽等)、喙(喙峰長，嘴裂，喙寬，喙高)和翅膀面積均未出現(xiàn)顯著差異，領(lǐng)雀嘴鵯的所有形態(tài)參數(shù)也同樣不存在顯著差異。繁殖競爭假說認(rèn)為，體型越大的個(gè)體，在雄性對雌性交配權(quán)的競爭以及領(lǐng)土的守衛(wèi)能力是有利的，雌性選擇競爭中的優(yōu)勢者，有利于體型較大雄性個(gè)體的基因傳播[20]，因此雄性競爭可以促使體重、體長、喙、跗蹠長等參數(shù)產(chǎn)生性二態(tài)[18-19]。而本研究中，這些指標(biāo)不存在顯著性差異的原因可能是兩種鵯的雌雄個(gè)體在爭奪交配權(quán)時(shí)存在相互選擇，在雌性選擇雄性個(gè)體部分形態(tài)指標(biāo)的同時(shí)，雄性也會相應(yīng)地選擇雌性的某些指標(biāo)(體重，體長等)，進(jìn)而導(dǎo)致雄性個(gè)體的這些形態(tài)與雌性差異不顯著。選型交配在部分鳥類，特別是一夫一妻制鳥類中已經(jīng)得到證實(shí)[35-36]。但白頭鵯與領(lǐng)雀嘴鵯性選擇行為及特征尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。其次，在性選擇對鳥類形態(tài)的作用小于自然選擇時(shí)，較強(qiáng)的自然選擇壓力會降低性選擇對雌雄形態(tài)分化的影響，導(dǎo)致雌雄差異不顯著[10，37]，因此可能導(dǎo)致白頭鵯體重、體長、喙等參數(shù)，領(lǐng)雀嘴鵯所有參數(shù)在本研究中雌雄差異不顯著。此外，Székely等[20]對世界鳥類性二態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)，性二態(tài)的存在可能與親緣關(guān)系有關(guān)，由于具有相似的繁殖策略與性選擇機(jī)制，同科鳥種會在某些共同指標(biāo)產(chǎn)生性二態(tài)，如部分織雀科(Ploceidae)鳥種的尾長與翅長存在性二態(tài)，且雄性極顯著大于雌性；部分鷹科(Accipitridae)鳥種的體重、翅長和尾長存在性二態(tài)，且雌性極顯著大于雄性。對比鵯科其他鳥種性二態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，雄性的尾長與翅長均顯著大于雌性[38-40]，但能否將這些參數(shù)作為鵯科鳥類性二態(tài)的共同特征，仍需深入研究。而兩種鵯雌雄差異不同，也可能是二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的一種體現(xiàn)。對國內(nèi)鵯科鳥類形態(tài)數(shù)值分類研究發(fā)現(xiàn)雀嘴鵯屬與冠鵯屬(Criniger)親緣關(guān)系較近，與鵯屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[21]；Shakya等[22]對世界鵯科鳥類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹也支持領(lǐng)雀嘴鵯與白頭鵯親緣關(guān)系遠(yuǎn)，且獨(dú)立分支置度達(dá)100%，由此推測領(lǐng)雀嘴鵯與白頭鵯在性二態(tài)上的不同也可能與二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)有關(guān)。另外自然選擇或性選擇對種內(nèi)不同種群的選擇壓力及強(qiáng)度或許不同，可能導(dǎo)致本研究中白頭鵯指明亞種長沙種群性二態(tài)與楊曉菁等[23]研究結(jié)果略有不同，該研究中的尾長、翅長存在性二態(tài)，喙寬不存在性二態(tài)與本研究結(jié)果相同；跗蹠長、喙峰長、喙高和體長存在性二態(tài)，與本研究結(jié)果相異。最后，由于鳥類視覺與人眼對顏色的感知并不完全相同，過去部分基于人眼辨別雌雄羽色是否存在二態(tài)性的研究存在偏差，一些研究證實(shí)部分鳥類的性二態(tài)體現(xiàn)在羽毛在紫外光下反射出的顏色[41]，這也許出現(xiàn)在鵯中，因此應(yīng)使用光譜進(jìn)一步分析雌雄間羽色或亮度等是否存在差異。