何美玲 張 麗 徐建坤 張林霞

孤獨(dú)癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorder，ASD)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，是兒童精神類疾病中最嚴(yán)重的一種，一般男童患病率是女童的4～5倍，患病兒童表現(xiàn)出社會(huì)交流障礙、語(yǔ)言交流障礙和重復(fù)刻板行為，嚴(yán)重危害兒童身心健康[1]。ASD病因目前尚未完全闡明，臨床治療仍以特殊教育訓(xùn)練為主，但若診斷或干預(yù)治療不及時(shí)會(huì)導(dǎo)致ASD伴隨患兒一生，嚴(yán)重影響患兒成年后生活質(zhì)量，這在重癥ASD患兒中尤為突出[2]。因此闡明ASD易感因素對(duì)早期診斷、預(yù)防及治療ASD具有十分重要的臨床意義。CD157也稱為骨髓基質(zhì)抗原1(Bone Marrow Stromal Antigen1，BST1)，已被證實(shí)作為一種信號(hào)分子在人粒細(xì)胞極化、遷移、分裂中起重要作用，參與多種疾病發(fā)病機(jī)制[3]。近年來(lái)研究表明，CD157/BST1基因多態(tài)性與帕金森發(fā)病有關(guān)，CD157/BST1基因缺陷小鼠表現(xiàn)出焦慮相關(guān)抑郁樣行為，提示CD157/BST1基因可能與神經(jīng)異常性疾病有關(guān)[4,5]。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，分析CD157/BST1基因rs4301112位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)與ASD患兒病情嚴(yán)重程度及發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2017年4月～2019年11月在濮陽(yáng)惠民醫(yī)院就診的102例ASD患兒作為研究組，ASD診斷由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的兒童精神病學(xué)專家通過(guò)對(duì)受試兒童父母訪談和對(duì)受試兒童行為觀察進(jìn)行確診，均符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第五版(DSM-V)中ASD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；排除智力發(fā)育障礙、兒童精神分裂癥、嬰兒癡呆(Heller綜合征)、埃斯博格綜合征(Asperger綜合征)等其他全面發(fā)育障礙及社會(huì)心理因素、耳聾等所引起的類似ASD癥狀。另選擇100名無(wú)精神發(fā)育遲滯、注意缺陷多動(dòng)障礙、抽動(dòng)障礙等神經(jīng)發(fā)育障礙的兒童志愿者為對(duì)照組。排除合并全身其他系統(tǒng)疾病兒童。研究組102例ASD患兒中，男59例，女43例，平均年齡(11.68±2.64)歲，出生時(shí)母親年齡(29.17±1.38)歲，剖宮產(chǎn)61例(59.80%)，母親接受高中以上教育80例(78.43%)；對(duì)照組100名兒童志愿者中男55名，女45名，平均年齡(12.11±2.78)歲，出生時(shí)母親年齡(28.86±1.29)歲，剖宮產(chǎn)57名(57.00%)，母親接受高中以上教育86名(86.00%)。兩組兒童性別、平均年齡、出生時(shí)母親年齡、剖宮產(chǎn)及母親接受高中以上教育等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得受試兒童家屬同意并簽署知情同意書，經(jīng)濮陽(yáng)惠民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表(Child Autism Rating Scale，CARS)評(píng)分及分組 使用CARS對(duì)ASD患兒病情進(jìn)行評(píng)定[7]，CARS包括人際關(guān)系、模仿行為、情感反應(yīng)、奇異的身體動(dòng)作或儀式化的行為、視覺(jué)反應(yīng)、聽(tīng)覺(jué)反應(yīng)、智力功能等15項(xiàng)內(nèi)容，每項(xiàng)內(nèi)容包括：正常(1分)表示兒童行為在該年齡段兒童中屬于正常，輕微不正常(2分)表示兒童行為與同齡期兒童相比輕微不正常，很不正常(3分)和極度不正常(4分)4個(gè)評(píng)分項(xiàng)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：總分<30分表示無(wú)ASD；30～37分有輕到中度ASD；38～60分有重度ASD。根據(jù)CARS評(píng)分結(jié)果，將102例研究組患兒分為輕中度組66例，重度組36例。

1.2.2 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型檢測(cè) 采集受試兒童肘靜脈血2 ml，加入EDTA抗凝，使用血液DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取血液樣本基因組DNA，使用UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司)檢測(cè)基因組DNA濃度及A260/A280值，并調(diào)整DNA濃度為50 ng/μl。以1 μl血液樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112片段，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，共45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收純化目的基因。采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用軟件GeneMapper4.0分析CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112的SNP。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 24.0分析數(shù)據(jù)，對(duì)基因型和等位基因分布頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Logistic回歸模型分析不同基因型與ASD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型及等位基因分布頻率 兩組CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型及等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有代表性。研究組AA基因型分布頻率低于對(duì)照組(P<0.05)，AG基因型分布頻率高于對(duì)照組(P<0.05)；兩組等位基因分布頻率比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

2.2 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112隱性/顯性基因型分布頻率 顯性模式下，兩組基因型分布頻率比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型分布與ASD嚴(yán)重程度關(guān)系 重度組AA基因型分布頻率低于輕中度組(P<0.05)，AG基因型分布頻率高于輕中度組(P<0.05)；輕中度組和重度組等位基因分布頻率比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型分布與ASD嚴(yán)重程度關(guān)系[n(%)]

2.4 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112多態(tài)性與ASD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 通過(guò)將AA、GG、AG+AA、AG+GG基因型以及年齡、出生時(shí)母親年齡、母親受教育年限、剖宮產(chǎn)等因素作為自變量，以是否發(fā)生ASD作為因變量進(jìn)行多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)AG+GG基因型是ASD發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112多態(tài)性與ASD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

3 討論

據(jù)報(bào)道，近年來(lái)兒童ASD患病率呈逐年上升趨勢(shì)，早期未經(jīng)及時(shí)診斷、干預(yù)治療的患兒具有較高終身殘疾率[8]。目前關(guān)于引起ASD的原因尚未完全闡明，普遍認(rèn)為其可能是由遺傳、病毒感染、孕產(chǎn)期危險(xiǎn)因素等多種因素造成的特定腦結(jié)構(gòu)或腦功能損傷所致[9,10]。近年來(lái)，隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，多項(xiàng)證據(jù)證實(shí)，基因SNPs與ASD易感性有關(guān)[11,12]。

CD157最初被發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨髓基質(zhì)細(xì)胞系中表達(dá)增強(qiáng)，是一種支持前B細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞表面分子[13]。以往CD157功能研究多集中在炎癥和免疫系統(tǒng)，證實(shí)CD157/BST1在體液免疫反應(yīng)、中性粒細(xì)胞遷移和造血干細(xì)胞支持中發(fā)揮多種作用，其還參與各種疾病的發(fā)病機(jī)制，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中B淋巴細(xì)胞存活，白血病進(jìn)展和人卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14,15]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，人類染色體4p15上CD157/BST1基因的SNP是帕金森病的危險(xiǎn)因素，證實(shí)CD157可能在胚胎和成人神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用[16]。但CD157/BST1基因多態(tài)性與ASD的關(guān)系研究尚不多。Shigeru Y等[17]檢測(cè)CD157/BST1基因的93個(gè)SNP與ASD的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)rs4301112和rs28532698位點(diǎn)SNP可能與ASD易感性有關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)，研究組AA基因型分布頻率低于對(duì)照組，AG基因型分布頻率高于對(duì)照組，兩組等位基因分布頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD157/BST1基因rs4301112位點(diǎn)遺傳變異可能與ASD發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，顯性模式下，研究組和對(duì)照組基因型分布頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而隱性模式下兩組基因型分布頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Shigeru Y等[17]支持隱性模型不同，這可能與地理環(huán)境因素有關(guān)。

ASD的臨床干預(yù)治療越早越好，尤其對(duì)程度較嚴(yán)重的ASD患兒，2歲時(shí)給予及時(shí)干預(yù)會(huì)有較好的成效，但超過(guò)3歲后干預(yù)治療效果較差，可能會(huì)導(dǎo)致ASD伴隨終生，給家庭帶來(lái)嚴(yán)重精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。BST1是一種糖基磷脂酰肌醇，在細(xì)胞膜外錨定核糖環(huán)化酶催化環(huán)化腺苷二磷酸核糖生成，是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要因子[18]。研究表明，Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性，且Ca2+對(duì)突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)等神經(jīng)元電活動(dòng)至關(guān)重要[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，重度組AA基因型分布頻率低于輕中度組，AG基因型分布頻率高于輕中度組，輕中度組和重度組等位基因分布頻率比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明不同嚴(yán)重程度的ASD患兒在同一基因位點(diǎn)的基因型分布可能不同，患兒間具有較強(qiáng)異質(zhì)性。因此，檢測(cè)CD157/BST1基因位點(diǎn)rs4301112基因型分布還可能有助于鑒別ASD嚴(yán)重程度，對(duì)改善ASD神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、改善患兒預(yù)后十分重要。本研究Logistic回歸模型分析顯示，CD157/BST1基因rs4301112位點(diǎn)AG+GG基因型是ASD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示CD157/BST1基因變異可能誘導(dǎo)或加重ASD發(fā)生。這可能與CD157/BST1基因變異破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能完整有關(guān)。

綜上所述，CD157/BST1基因rs4301112位點(diǎn)AG+GG基因型與ASD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及病情嚴(yán)重程度有關(guān)。但本研究存在樣本量較小，未考慮環(huán)境因素等不足，此外未考慮基因SNPs與環(huán)境和人群種族差異關(guān)系。因此，CD157/BST1基因多態(tài)性與ASD的關(guān)系還需進(jìn)行大樣本量、多中心的研究證實(shí)。