李 梁，楊彩霞，侯秋實，王筠竹，于美春

（沈陽大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院/遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室，沈陽 110044）

蠶豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus, BBWV)是豇豆花葉病毒科(Comoviridae)蠶豆病毒屬(Fabavirus)的典型種，其基因組由 2 條單鏈 RNA 分子組成，分別為 6.0kb 的 RNA1 和 3.6 kb 的 RNA2。BBWV 有 2 種血清型，根據(jù)不同的血清型分為兩個種：BBWV1 和BBWV2[1]。RNA1 編碼的多聚蛋白進一步加工成5 種功能蛋白：輔因子(protease cofactor)、解旋酶(Helicase)、蛋白酶(protease)、基因結(jié)合蛋白(NTP-binding protein)和 RNA依賴性RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase)。RNA2 編碼的一種多蛋白進一步加工形成3 種功能蛋白，1 種運動蛋白 (movement protein, MP) 和2 種衣殼蛋白 (large coat protein:LCP 和small coat protein:SCP)[2]。1947 年，STUBBS[3]首次從蠶豆中發(fā)現(xiàn)蠶豆萎蔫病毒。1982 年，奚仲興等[4]在我國首次發(fā)現(xiàn)蠶豆萎蔫病毒。周雪平等[5]測定了BBWV2 中國分離物(B935)的全基因序列，并分析了其基因表達和蛋白功能。牛顏冰等[6]在山西省泰山區(qū)植物栽培基地調(diào)查辣椒病，確定辣椒病毒病的病原體是BBWV2，并獲得BBWV2 辣椒分離株(BBWV2-Ca)的完整基因組序列。王曉燕[7]完成一串紅BBWV2 分離株S4 的分子鑒定和基因組測定，并報道BBWV2 辣椒分離株XJP1-1 和番茄分離株XI14-3a 的序列差異。本研究對侵染遼寧藜植物的病毒分離物BBWV2 進行鑒定，首次報道BBWV2 遼寧藜分離物RNA1 和RNA2 的基因組序列，為病毒的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016 年6 月，于遼寧省沈陽市發(fā)現(xiàn)疑似病毒侵染的藜樣品。病株表現(xiàn)系統(tǒng)性病變，葉肉退化或消失僅存中肋，葉片僵硬，數(shù)條葉脈由葉基部延申使葉片皺縮呈扇形。采集病葉存于-80℃超低溫冰箱備用（圖1）。

大 腸 桿 菌 DH-5α 菌 株 、RNASimple Total RNA Kit、總 RNA 提取試劑盒、TIANScript Ⅱ cDNA 第一條鏈合成試劑盒和TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒均購自天根生化科技 (北京) 有限公司；DNA ladder DL2000、Ex Taq 酶、dNTP和PMD-18T 連接試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。

圖1 藜皺縮癥狀葉片樣品（a.整株植物；b.單個葉片）Figure 1 The Chenopodium album L.plants showing shrink leaf symptoms（a.Whole plant; b.Single leaf）

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和質(zhì)量檢測 CTAB 法提取病樣總 RNA 后，利用 Nanodrop 2000 檢測總 RNA 的OD260、OD280和 OD230值，期望獲得 OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.8 的達標(biāo)樣品。OD 值越接近標(biāo)準(zhǔn)值建庫失敗的風(fēng)險越小，反之則風(fēng)險越大。利用Agilent 2100 測定RNA 的完整性，期待獲得高RIN 值，RIN 值越高說明 RNA 的質(zhì)量越好[8]。利用Agilent 2100 檢測28S/18S 判斷樣品的Total RNA 是否降解(深圳華大基因科技有限公司)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建 取一定量質(zhì)量達標(biāo)的Total RNA 樣品，DNaseI 消化樣品中存在的DNA，磁珠純化回收反應(yīng)產(chǎn)物后溶于DEPC 水中。取消化的Total RNA 樣品，用Ribo-Zero 試劑盒去除總RNA 中高含量的rRNA；在上一步回收的RNA 中加入打斷試劑形成片段化的RNA，其在隨機N6 引物的指導(dǎo)下反轉(zhuǎn)得到cDNA，進而形成雙鏈DNA。把合成的雙鏈DNA 末端補平并5’端磷酸化，3' 端加上一個“A”的粘末端，再連接一個3' 端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。連接產(chǎn)物通過特異的引物進行PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物熱變性成單鏈，再用一段橋式引物將單鏈DNA 環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA 文庫，上機測序 (深圳華大基因科技有限公司)。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序原始數(shù)據(jù)處理與分析 Raw Reads 需經(jīng)過過濾去除那些低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N 含量過高的 reads，從而得到clean reads。使用CLC genomics Workbench (Aarhus, Denmark) 軟件對 clean reads 進行進一步組裝拼接以期獲得較長的contigs?；诘玫降腸ontigs，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLASTn 或者BLASTx 程序，尋找那些可能是病毒來源的contigs (高通量數(shù)據(jù)分析由西南大學(xué)曹孟籍副研究員完成）[9]。

1.2.4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計引物 基于搜尋到的同源序列，把contigs 在病毒基因組上的位置標(biāo)記出來，供PCR 引物設(shè)計參考。擴增RNA1 的引物序列見表1，擴增RNA2 基因組序列的引物見表2。

1.2.5 病毒的RT-PCR 檢測 取藜皺縮癥狀葉片樣品10 mg，于研缽里面添加液氮之后立即研磨為粉末狀，通過RNASimple Total RNA Kit 總RNA 提取試劑盒和TIANScript Ⅱ cDNA 第一條鏈合成試劑盒提取到藜樣品的總 RNA 以及 cDNA 的合成。向 PCR 管中依次加入病樣總 RNA 3μL、Oligo-(dT)15(10μmol·L-1) 2μL和 Super Pure dNTPs (10m mol·L-1) 1μL，再加入 RNase-free H2O 補充至 14.5μL，混勻后置于 65℃金屬浴上孵育5min；迅速轉(zhuǎn)至冰上 2min；將上述溶液瞬離后加入 5×TIANScript Ⅱ RNase Buffer 4μL、RNasin (40units·μL-1)0.5μL、TIANScript Ⅱ RTase (200units·μL-1)1μL 混勻，于 42℃金屬浴上孵育 60min，轉(zhuǎn)入 85℃金屬浴加熱5min 終止反應(yīng)，補充 RNase free H2O 20μL 即得到 cDNA，置-20℃冰箱保存。以 cDNA 為模板，進行 PCR 擴增。通過轉(zhuǎn)錄組測序設(shè)計7 對引物對病毒的全基因組進行擴增。PCR 反應(yīng)體系為25μL，設(shè)置的PCR 程序是：94℃條件下 3min；94℃條件下 40s，50～55℃條件下 40s，72℃條件下 1min，實驗需完成 30～40 個循環(huán)；于 72℃條件下延伸10min。

表1 用于擴增BBWV2-RNA1 基因組的PCR 反應(yīng)引物Table 1 Polymerase chain reaction primers used for amplification of the BBWV2-RNA1 genome

表2 用于擴增BBWV2-RNA2 基因組的PCR 反應(yīng)引物Table 2 Polymerase chain reaction primers used for amplification of the BBWV2-RNA2 genome

反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠針對PCR 產(chǎn)物實施電泳檢測，把目的條帶用TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒完成回收與純化處理。把回收產(chǎn)物和pMD-18T 克隆載體于16℃條件下實施連接3h 后轉(zhuǎn)入DH5α 菌株的感受態(tài)細胞；在LB 液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)1h 后，取100μL 轉(zhuǎn)化液均勻涂于LB 固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落至5 mL LB(Amp)液體培養(yǎng)基里，37℃下230r·min-1搖床中培養(yǎng)過夜。取出2μL 菌液實施菌液PCR 鑒定，陽性樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.6 序列分析 通過DNAStar 和DNAMAN Version 6.0 軟件針對測序結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，并借助美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫當(dāng)中的BLAST 程序搜索同源序列。通過應(yīng)用DNAStar 的Clustal V 程序可完成同源性分析，并以Clustal_X version 1.83[10]實施完全比對，接著以MEGA version 5.13 軟件基于最大似然法完成親緣關(guān)系樹的繪制，設(shè)定種子重復(fù)數(shù)量為1000，分支節(jié)點之上的數(shù)值是后驗概率，超過50%顯示。

1.2.7 BBWV-2 特異性檢測 選取6 株病癥明顯的藜植株提取RNA 和cDNA 的合成，利用R2/3F 引物對BBWV-2 進行檢測。同時，選取2 株無病癥的藜作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 質(zhì)量檢測

本實驗得到 OD260/280為 2.09，OD260/230為 1.85；RIN 值為 7，28S/18S 為 1.3 的質(zhì)量合格的 RNA 樣品，可以用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及分析

使用BGISEQ-500 平臺一共測了11.83Gb 數(shù)據(jù)，得到的總Raw Reads 為132.87M，過濾后得到總CleanReads 為 118.25 M。過濾后 reads 通過 CLC Genomics Workbench 生物信息軟件進行過濾和拼接，得到的長度為 5945 和 3550 的 2 個 contigs。進 行 BLASTn 和BLASTx 比對，發(fā)現(xiàn)其與BBWV2 的高度同源。

2.3 RT-PCR 檢測結(jié)果

利用引物 R1-1F/R1-1R、R1-2F/R1-2R、R1-3F/R1-3R、R1-4F/M4 對藜病葉的 cDNA 實施病毒 RNA1基因組的擴增，獲得大小分別約為1700bp (泳道1)、1700bp (泳道 3)、1700bp (泳道 5)和 800bp (泳道 7)的電泳條帶。利用引物 R2-1F/R2-1R、R2-2F/R2-2R 和R2-3F/M4 對藜病葉的cDNA 實施病毒RNA2 基因組的擴增，獲得大小分別約為1600bp (泳道9 和11)和350bp (泳道13)的電泳條帶。所有電泳條帶與預(yù)期大小相符，但沒有在健康植物中擴到條帶(圖2)。將陽性條帶進行回收純化之后連接克隆載體pMD18T 進行克隆測序。

圖2 藜病葉BBMV2 病毒全長基因組的 PCR 擴增結(jié)果Figure 2 PCR amplification of full-length genome of BBWV2 associated with Chenopodium album L.

2.4 基因結(jié)構(gòu)分析

測得序列通過DNAMAN 生物軟件進行拼接組裝，獲得藜樣品當(dāng)中病毒的RNA1 基因組，長5891 nt(GenBank 登錄號為 MN786954)，RNA2 基因組長為 3549 nt (GenBank 登錄號為 MN786955)。通過 ORF finder程序分析RNA1 和RNA2 的基因結(jié)構(gòu)。RNA1 和 RNA2 分別編碼一個多聚蛋白，位于RNA1 的150-5756 nt(1868 aa) 和 RNA2 的 161-3355 nt (1064 aa)。其中，RNA2 含有 MP (161-1555 nt，465 aa)、LCP (1556-2761 nt，402 aa)和 SCP (2762-3352 nt，197aa)。

2.5 同源性分析和進化樹構(gòu)建

基于RNA1 序列在Blast 中查找同源序列，發(fā)現(xiàn)與Broad bean wilt virus 2 (BBWV2) RNA1 序列的同源在79.70%～84.00%。挑選代表性的RNA1 序列，基于全序列利用DNASTAR 軟件Clustal W 進行比對，發(fā)現(xiàn)與BBWV2 遼寧芝麻分離物BBWV2-[CN:Sesamum indicum](MK116519)最同源，達到83.4%，其次是跟中國白術(shù)分離物BBWV2-[CN:atractylodes macrocephala](JX575182)，同源性達到80.99%。同源性最低的是新加坡分離物 BBWV2-[Singapore]，為 78.03%（表3）。

基于RNA2 序列在Blast 中查找同源序列，發(fā)現(xiàn)與Broad bean wilt virus 2 (BBWV2)RNA2 序列的同源在77.59%～88.83%，其中同源性最高的是BBWV2 中國生地分離物BBWV2-[CN:Rehmannia](GQ20221)，其次是中國山西辣椒分離物BBWV2-[CN:Sx:Capsicum](KF498697)，為86.55%。挑選代表性的RNA2 序列進行cp基因的同源性比對，結(jié)果顯示，基于氨基酸序列時藜分離物與韓國益母草分離物BBWV2-[SK:AD:Leonurus](KM076649)的同源性最高，為96.5%；其次與中國新疆辣椒分離物BBWV2-[CN:XJ:Pepper](HQ283390)同源性為95.8%?；诤塑账岜葘r，與山西辣椒分離物BBWV2-[CN:Sx:Capsicum](KF498697)同源性最高的，為85.9%；其次是與中國山西辣椒分離物BBWV2-[CN:XJ;pepper](HQ283390)同源性為84.9%(表4)。BBWV2 藜分離物CP 氨基酸序列與報道的BBWV2 分離物CP 同源性高于標(biāo)準(zhǔn) (CP 氨基酸序列相似性小于75%)，可見，其為BBWV2 的遼寧藜分離物 (BBWV2-LNSY)。

基于RNA1 全序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(圖3)，BBWV2 藜分離物與遼寧芝麻分離物BBWV2-[CN:LN:Sesamum](MK118749)、韓國安東益母草分離物BBWV2-[SK: AD: Leonurus sibiricus](KM076648)系統(tǒng)關(guān)系最近，聚集在同一個分支上?；赗NA2 的cp 基因構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹 (圖4)，BBWV2 藜分離物與新疆辣椒分離物BBWV2-[CN:XJ;pepper](HQ283390)、韓國安東益母草分離物BBWV2-[SK:AD:Leonurus](KM076649)、遼寧芝麻分離物BBWV2-[CN:LN:Sesamum](MK118749)、山西辣椒分離物BBWV2-[CN:Sx:Capsicum](KF498697)、山西白術(shù)分離物BBWV2-[CN:SX:Atractylodes](KC110085)關(guān)系最近，聚類在一個分支上。而中國其他地區(qū)分離物，例如中國浙江豇豆分離物BBWV2-[CN:ZJ:cowpea](AJ312437)、中國安徽蠶豆分離物BBWV2-[CN:AH:Via](KY606993)、中國山東山藥分離物BBWV2-[CN:SD:Dioscorea (KJ789137)、中國湖南辣椒分離物BBWV2-[CN:Hu:Chi](KJ825857)、中國浙江豇豆分離物 BBWV2-[CN:ZJ:cowpea](AJ312437) 則在其他分支上。MN786956 作為群外組單獨一個分支。BBWV2 分離物所在分支既存在中國遼寧芝麻分離物也有韓國安東益母草分離物，說明其間親緣關(guān)系較近，可能來源于韓國[11]。

表3 BBWV2-RNA1 與相關(guān)的病毒核苷酸序列的同源性比對Table 3 Homology comparison of BBWV2-RNA1 with related viral nucleotide sequences

2.6 BBWV 與藜病害伴隨檢測

利用R2/3F 引物對6 株病癥明顯的藜植株進行BBWV2 的特異性檢測，發(fā)現(xiàn)6 株樣品均有350bp 的目的片段出現(xiàn)。但是，在無病癥的兩株藜樣品中沒有擴增到該特異片段?？梢?，BBWV2 與藜病害相伴隨。

3 討論與結(jié)論

藜(Chenopodium album L.)為藜科藜屬植物，是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要雜草之一[12]。目前，在歐洲和北美均有藜自然條件下被馬鈴薯Y 病毒(Potato Y Virus, PVY)[13]侵染的報道，但在中國尚無藜病毒病發(fā)生的報道。前期病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)沈陽地區(qū)常見雜草藜上表現(xiàn)嚴重的皺縮癥狀，通過轉(zhuǎn)錄組測序和RT-PCR 驗證確定該分離物具有2 條RNA，均與BBWV2 最同源。分析RNA1 和RNA2 的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其具有典型的豇豆花葉病毒科(Comoviridae)病毒基因組結(jié)構(gòu)特點?；赗NA2 編碼的CP 氨基酸序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與其他已經(jīng)發(fā)表的BBWV2 分離物的同源性均在80%以上。因此，根據(jù)國際病毒分類委員會(ICTV)第十次報告中報道的Fabavirus 分類標(biāo)準(zhǔn)(CP 氨基酸序列相似性小于75%，可認為是不同病毒種) ，可判定侵染沈陽藜植物的病毒為BBWV2 的遼寧分離物，這是國際上有關(guān)BBWV2 自然侵染藜的首次報道。此外，本研究通過特異性片段檢測初步判斷BBWV2 與藜病害相伴隨。但是，由于缺少柯赫氏法則的驗證，尚不能斷定藜病害由BBWV2 所致，不排除BBWV2 自然條件下與其他種類病毒復(fù)合侵染所致。后續(xù)實驗將嘗試構(gòu)建BBWV2 的侵染性克隆，為更多地了解其致病特性提供數(shù)據(jù)。

表4 BBWV2 遼寧分離物與其他報道BBWV2 分離物的cp 基因的氨基酸與核苷酸序列同源性Table 4 Percentage of amino acid and nucleotide sequence identities between cp gene of isolates of Liaoning and other published BBWV2 isolates

圖3 基于已報道的BBWV2 RNA1 基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Figure 3 Phylogenetic trees based on RNA1 sequences of the previously reported BBWV2

圖4 基于已報道的BBWV2 cp 基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹Figure 4 phylogenetic trees based on cp nucleotide sequences of the previously reported BBWV2

BBWV2 寄主范圍很廣，可侵染44 科 186 屬328 種植物，是世界流行性病毒病原[14-16]。在中國，BBWV2已經(jīng)在新疆、安徽、云南、山西和湖南等地區(qū)發(fā)生和危害，不僅能侵染蠶豆、青椒、煙草、花卉和中草藥[17-21]，還能侵染葡萄等多種木本植物，引起花葉、矮化、萎蔫和植株枯死，導(dǎo)致明顯的負面危害[22]。劉勇等[23]于2013～2017 年間對我國 31 個省(市、自治區(qū))開展的蔬菜作物主要病毒病發(fā)生情況進行普查，發(fā)現(xiàn)BBWV2 在23個地區(qū)的蔬菜作物有4.82%的高檢出率，指出BBWV2 是當(dāng)前危害我國蔬菜作物的四種優(yōu)勢病毒之一，也是遼寧地區(qū)蔬菜的四種優(yōu)勢病毒之一。在遼寧地區(qū)，徐千惠等[24]首次調(diào)查了5 個蔬菜種植區(qū)BBWV2 的危害情況，發(fā)現(xiàn)其檢出率為0.9%，嚴重為害番茄、辣椒和菜豆等多種蔬菜作物。鑒于BBWV2 的高危害性以及藜在中國各地廣泛分布，極易造成BBWV2 的大面積蔓延進而嚴重危害遼寧地區(qū)蔬菜生產(chǎn)，有必要繼續(xù)系統(tǒng)地針對BBWV2 病害實施調(diào)查與檢測，為該病害防治工作奠定基礎(chǔ)支撐。