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(1.哈爾濱體育學(xué)院,哈爾濱 150008; 2.廣東省檢迅檢測科技有限公司,東莞 523843;3.深圳市匯知科技有限公司,深圳 518101; 4.深圳市通量檢測科技有限公司,深圳 518102)

漿果類水果品種繁多[1-3],如葡萄、草莓、番茄、獼猴桃和無花果等,深受廣大人民群眾的喜愛,是人類日常食用的水果大類;我國是漿果類水果種植大國,如我國葡萄種植面積現(xiàn)居世界第二位,種植品種約100種之多,漿果類水果在種植過程中,病蟲害是影響該產(chǎn)業(yè)的最主要的因素。據(jù)統(tǒng)計,危害葡萄的病蟲害有40多種[4-7],霜霉病、灰霉病等是影響其產(chǎn)量最主要的因素;酰胺類殺菌劑[8-10]是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酰胺結(jié)構(gòu)的一類化學(xué)殺菌劑,對防治漿果類水果中的霜霉病、灰霉病等有較好的效果。目前,酰胺類殺菌劑是近年來新品種開發(fā)最多的一類殺菌劑,市場份額逐年增加;酰胺類殺菌劑具有廣譜、低毒、易降解等特點,但誤食用到該類殺菌劑仍會對人類的身體造成亞急性中毒,輕者頭暈和心悸等,重者嘔吐、痙攣和四肢無力等,因此加強對漿果類水果中酰胺類殺菌劑殘留量的監(jiān)測,具有十分重要的意義。

目前,漿果類水果中農(nóng)藥殘留檢測前處理的主要方法有固相萃取法[11]、凝膠凈化色譜-濃縮法[12-13]和QuEChERS提取法[14-17]。國家標準GB 23200.8-2016《水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定》中氣相色譜-質(zhì)譜法是較為權(quán)威的測定方法,其中前處理方法為氨基柱(NH2)固相萃取法。固相萃取法和凝膠凈化色譜-濃縮法,儀器自動化程度高,但處理過程冗長,處理過程中易造成待測物的損失,檢測準確度較低,且試劑的使用量較大,易對環(huán)境造成污染;QuECh ERS提取法是近年來發(fā)展起來的一種快速樣品前處理技術(shù),處理過程簡單,效率高且檢測準確度高,溶劑使用量低,環(huán)境友好度高。本工作采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄等漿果中7種酰胺類殺菌劑殘留量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

2010 PLUS型氣相色譜儀;TQ-8040型三重四極桿質(zhì)譜儀;AB-135型電子天平;N-EVAP型氮吹儀;H205R型高速冷凍離心機。

環(huán)氧七氯(內(nèi)標液)、甲霜靈、呋霜靈、苯霜靈、環(huán)酰菌胺、苯酰菌胺、環(huán)氟菌胺、噻呋酰胺標準溶液:100 mg·L-1。

內(nèi)標溶液:移取100 mg·L-1環(huán)氧七氯標準溶液1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,用正己烷稀釋、溶解,配制成質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的溶液,備用。

標準儲備溶液:分別移取質(zhì)量濃度均為100 mg·L-1的甲霜靈、呋霜靈、苯霜靈、環(huán)酰菌胺、苯酰菌胺、環(huán)氟菌胺、噻呋酰胺標準溶液各2.00 mL,置于20 mL容量瓶中,用正己烷溶解、定容,配制成質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的標準儲備溶液。使用時用正己烷稀釋至所需質(zhì)量濃度。

乙腈、正己烷均為色譜純;N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、十八烷基硅烷(C18);無水硫酸鎂、乙酸均為分析純。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),柱溫320 ℃,進樣口溫度為250 ℃;不分流進樣;載氣為氦氣,純度大于99.999%,載氣流量為1.8 mL·min-1;進樣量為1.0μL。柱升溫程序:初始溫度60℃,保持2 min;以20 ℃·min-1速率升溫至180 ℃,保持3 min;再以15 ℃·min-1速率升溫至280 ℃,保持10 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;轟擊能量為70 e V;離子源溫度為260 ℃;接口溫度為250 ℃;碰撞氣為氬氣(純度大于99.999%);溶劑延遲時間為3.0 min;其余質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

將新鮮采摘的葡萄樣品用粉碎機粉碎、充分攪勻,制成勻漿。稱取已均質(zhì)的葡萄樣品5.0 g,放入25 mL離心管中,加入1%(體積分數(shù),下同)乙酸-乙腈溶液20 mL,無水硫酸鎂5 g,振搖10 min,以6 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min。將離心后的有機層溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入無水硫酸鎂1.0 g、PSA 500 mg和C18500 mg,GCB 500 mg的25 mL離心管中,劇烈振搖3 min,使樣品得以充分凈化。再以6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min。取上清液5.0 mL至刻度試管中,于60 ℃水浴式氮吹儀中用氮氣吹至近干,殘渣用正己烷定容至1.0 mL。經(jīng)0.2μm有機濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至小進樣瓶中,加入10 mg·L-1的環(huán)氧七氯溶液20μL,混勻,按照儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

7種殺菌劑混合標準溶液的標準譜圖見圖1。

圖1 7種殺菌劑混合標準溶液的標準譜圖Fig.1 Standard spectrum of mixed standard solution of seven fungicides

2.2 前處理方法的選擇

試驗分別考察了氨基固相萃取柱和Qu ECh ERS前處理方式對樣品凈化和回收效果的影響,在空白葡萄樣品中加入質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1的7種酰胺類殺菌劑混合標準溶液,按照儀器工作條件進行測定,結(jié)果見表2。

由表2可知:氨基固相萃取柱凈化效果較好,但是樣品的回收率最低;QuEChERS前處理方式所得的測定結(jié)果中7種酰胺類殺菌劑的回收率均高于固相萃取柱萃取結(jié)果。原因可能是氨基固相萃取柱對酰胺類殺菌劑的吸附性較強,Qu ECh ERS所用的凈化劑PSB、GCB和C18為非極性,對酰胺類殺菌劑無吸附作用。考慮到Qu ECh ERS處理過程中所用溶劑較少、且前處理快速,試驗選擇QuEChERS作為前處理方式。

表2 QuEChERS方法與國家標準前處理方法提取結(jié)果比較Tab.2 Comparison of extraction results of pre-treatment method of QuEChERSand national standard%

2.3 萃取溶劑的選擇

試驗考察了乙酸乙酯、丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液等4種不同萃取溶劑的萃取效果。在加入最終質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1的混合標準溶液時,其他條件保持不變,按照試驗條件測定了乙酸乙酯、丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液等萃取溶劑所得到的回收率,測定結(jié)果見表3。

表3 不同溶劑萃取效果的比較Tab.3 Comparison of extraction efficiency of different solvents%

由表3可知:乙酸乙酯萃取時,葡萄等漿果中的糖分、蠟質(zhì)也被共提出來,質(zhì)譜離子肼及氣相色譜進樣口容易污染導(dǎo)致靈敏度降低;丙酮作為萃取溶劑時,由于丙酮的極性較弱,對極性較強的農(nóng)藥如環(huán)酰菌胺、環(huán)氟菌胺等萃取效果不理想,回收率偏低。乙腈是萃取中應(yīng)用最多的一種溶劑,對大多數(shù)農(nóng)藥溶解性好,共提物少,可以有效降低基線噪聲,提高檢測靈敏度?？紤]到酸堿敏感性農(nóng)藥的穩(wěn)定性,試驗選擇了1%乙酸-乙腈溶液為萃取溶劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

基質(zhì)效應(yīng)是待測樣品中除目標物以外的其他成分對測定結(jié)果的影響。一般來說,不同的樣品基質(zhì)對測定值的影響亦不同。研究表明:在氣相色譜-質(zhì)譜法中,大多數(shù)樣品對待測物存在基質(zhì)增強效應(yīng)。當前農(nóng)殘?zhí)幚沓Ｓ玫南|(zhì)效應(yīng)的方法為基質(zhì)匹配標準法,該方法以模擬樣品環(huán)境的方式(如稱取待測樣品,在萃取、凈化、濃縮后的提取物中,用標準曲線溶液系列配制不同濃度點的基質(zhì)匹配溶液)來補償樣品中農(nóng)藥的吸附或降解。試驗采用加入內(nèi)標物環(huán)氧七氯的方式來消除色譜系統(tǒng)進樣帶來的誤差及前處理導(dǎo)致的損失?；|(zhì)標準液內(nèi)標法為本方法定量檢測的依據(jù)。本方法仍以加入質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1的混合標準溶液來考察標準溶液與內(nèi)標基質(zhì)匹配標準溶液校正所得到的回收率,結(jié)果見表4。

表4 純標準溶液與基質(zhì)匹配標準溶液比較Tab.4 Comparisons of pure standard solution and matrix matching standard solution%

由表4可知:加入內(nèi)標物環(huán)氧七氯后,7種殺菌劑殘留量的回收率為89.2%～93.6%,相比較未加內(nèi)標物回收率為82.6%～89.5%,說明采用環(huán)氧七氯作為內(nèi)標物的方法具有更好的準確度。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用Q3SCAN全掃描模式對10 mg·L-1的混合標準溶液進行全掃描,得到7種酰胺類殺菌劑相對應(yīng)的前體離子及保留時間;運行不同碰撞能量產(chǎn)物離子掃描方法,自動比較數(shù)據(jù)文件,選擇合適的產(chǎn)物離子和合適的碰撞能量,然后在該電壓下對產(chǎn)物離子進行掃描,得到各自對應(yīng)的碎片離子;選擇響應(yīng)較高的離子對作為定量離子對,另選擇兩組離子對作為定性離子對。保留時間、特征離子對保證定性結(jié)果的準確性;排除了假陽性樣品。使用wizard功能重新優(yōu)化參比離子的比率,各農(nóng)藥殘留的靈敏度均達到最佳狀態(tài),檢測結(jié)果更加準確、可靠,最終生成MRM檢測方法。

2.6 標準曲線與檢出限

按試驗方法對0.04,0.1,0.4,1.0,2.0,4.0 mg·L-1的7種酰胺類殺菌劑混合標準溶液系列進行測定,并繪制標準曲線。結(jié)果表明:7種酰胺類殺菌劑的線性范圍均為0.04～4.0 mg·L-1,其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表5。

以空白葡萄樣品的低濃度水平(0.02 mg·kg-1)加標回收的響應(yīng)為基礎(chǔ),以3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),10倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),結(jié)果見表5。

表5 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和測定下限Tab.5 Linear regression equations,correlation coefficients,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度與回收試驗

按照試驗方法對空白葡萄樣品進行加標回收試驗,加標量為0.05,0.1,1.0 mg·L-1,每個加標樣品平行進樣6次,考察6次測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表6。

由表6可知:3個不同水平的加標回收率為86.2%～100%,RSD為1.6%～4.1%,符合方法中精密度要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對葡萄、藍莓、獼猴桃等3種漿果類水果中7種酰胺類殺菌劑進行測定。結(jié)果表明:葡萄、藍莓與獼猴桃中分別檢出甲霜靈為0.011 mg·kg-1、環(huán)酰菌胺為0.012 mg·kg-1、環(huán)酰菌胺為0.008 mg·kg-1。

本工作采用QuEChERS前處理方法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了葡萄等漿果中酰胺類殺菌劑殘留量的測定方法。對前處理方法、萃取溶劑及質(zhì)譜參數(shù)等進行了討論;考察了方法的線性、檢出限及精密度。對葡萄、藍莓和獼猴桃等漿果類樣品進行了測定。該方法縮短了前處理時間,減少了萃取溶劑的使用量,運用三重四極桿質(zhì)譜分析,避免了假陽性樣品的存在。

表6 精密度與回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.6 Results of tests for precision and recovery(n＝6)