盛 楠 馬雪萍 逄淑云 宋沁馨,2 鄒秉杰*,3 周國(guó)華*,3,4

1(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥理科， 南京210002) 2(藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國(guó)藥科大學(xué)， 南京 210009) 3(南京大學(xué)生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210093) 4(南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 南京210002)

1 引 言

自2019年12月底出現(xiàn)不明原因引發(fā)的聚集性肺炎感染事件以來(lái)[1～3]，新型冠狀病毒迅速蔓延全球。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，截至2020年5月1日，新型冠狀病毒感染人數(shù)超過(guò)300萬(wàn)，疫情已影響215個(gè)國(guó)家和地區(qū)[4]，對(duì)全球人類的健康與生活造成了極大的威脅。

新型冠狀病毒是一種RNA正鏈病毒，與SARS-CoV序列相似性達(dá)79.6%[5]，2020年2月11日，國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)暫將新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2，由其引發(fā)的疾病統(tǒng)稱為COVID-19(Coronavirus disease 2019)[6]。盡管感染SARS-CoV-2的患者也會(huì)出現(xiàn)與SARS-CoV和MERS-CoV感染類似的臨床癥狀，如發(fā)熱、干咳、呼吸困難和雙側(cè)磨玻璃密度影等，且病毒潛伏期長(zhǎng)，存在無(wú)癥狀感染者[7]， 但不同的是，多數(shù)SARS-CoV-2感染患者上呼吸道癥狀并不明顯[8]。此外，SARS-CoV-2表面的S蛋白與人受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)的結(jié)合力遠(yuǎn)高于SARS-CoV[9]，這為SARS-CoV-2傳染性強(qiáng)于SARS-CoV提供了分子基礎(chǔ)。正是由于多方面因素的影響，疫情早期的發(fā)現(xiàn)及防控工作中存在巨大困難，最終出現(xiàn)了SARS-CoV-2感染人數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)的局面。

在缺乏特效藥物并且疫苗尚未問世的情況下，準(zhǔn)確快速地甄別出SARS-CoV-2感染者， 并對(duì)其實(shí)施隔離是目前疫情防控的最有效手段[10]。核酸檢測(cè)在此次疫情防控中起到了至關(guān)重要的作用，尤其對(duì)于無(wú)癥狀感染者的確診和康復(fù)期患者的出院評(píng)判，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)成為了主要標(biāo)準(zhǔn)[11]。因此，發(fā)展方便、快速、準(zhǔn)確的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)方法對(duì)疫情防控尤其重要。

從疫情爆發(fā)至今，已開發(fā)出多種SARS-CoV-2核酸檢測(cè)方法，這些方法原理各異，利用的檢測(cè)平臺(tái)不同，有各自的優(yōu)缺點(diǎn)與適用范圍。本文將根據(jù)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)現(xiàn)有的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹和比較，為臨床選擇合適的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)提供參考，并對(duì)今后建立更安全、更準(zhǔn)確、更快速的病原體核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)提出了展望。

2 基于不同平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

2.1 基于高通量測(cè)序平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

DNA高通量測(cè)序技術(shù)憑借其直接測(cè)定基因組序列、通量高等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)成為核酸檢測(cè)的重要工具，涌現(xiàn)出很多測(cè)序平臺(tái)，如454焦磷酸測(cè)序[12]、Solexa測(cè)序[13]等第二代測(cè)序平臺(tái)，以及SMRT測(cè)序[14]、納米孔測(cè)序[15]等第三代測(cè)序平臺(tái)。這些平臺(tái)在疾病診斷[16]、微生物群落分析[17]、病原體鑒定[18]等方面應(yīng)用廣泛。此次疫情中的病原體也是通過(guò)第二代測(cè)序平臺(tái)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(圖1)分析患者肺泡灌洗液樣本所發(fā)現(xiàn)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)顯示，SARS-CoV-2與SL-CoVZC45病毒的序列一致性達(dá)89.1%[19]。得益于高通量測(cè)序技術(shù)，研究人員在疫情初期獲得樣本的第一時(shí)間進(jìn)行測(cè)序， 獲取了SARS-CoV-2的完整序列信息，為后續(xù)建立快速檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原理(SBS測(cè)序法)Fig.1 Principle of transcriptome sequencing (SBS sequencing)SBS, sequencing by synthesis

因此，高通量測(cè)序平臺(tái)最大的優(yōu)勢(shì)在于可發(fā)現(xiàn)未知病原體，并獲得未知病原體的基因全序列，非常適用于疫情爆發(fā)初期病原體的甄別，并為進(jìn)一步開發(fā)病原體核酸檢測(cè)方法提供序列信息。此外，采用高通量測(cè)序技術(shù)還能實(shí)時(shí)跟蹤病原體核酸的變異情況，這在病原體溯源、疫苗開發(fā)、疾病流行趨勢(shì)的預(yù)判等方面具有重要作用。

然而，高通量測(cè)序平臺(tái)在進(jìn)行病原體檢測(cè)時(shí)，常因其儀器價(jià)格高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高等問題而難以推廣應(yīng)用。與其它測(cè)序平臺(tái)相比，納米孔測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，可進(jìn)行RNA的直接測(cè)序，從測(cè)序到出結(jié)果的時(shí)間可由數(shù)天縮減至數(shù)小時(shí)，并能實(shí)時(shí)輸出測(cè)序結(jié)果，儀器設(shè)備小巧，因此, 在病原體檢測(cè)方面具有一定優(yōu)勢(shì)。近期，武漢大學(xué)劉天罡教授等組建的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)開發(fā)了利用MinION納米孔測(cè)序平臺(tái)建立的靶向多重呼吸道病原體檢測(cè)方法[20]，可在6～10 h內(nèi)對(duì)包括SARS-CoV-2在內(nèi)的多種呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信會(huì)有更快、更簡(jiǎn)便、更準(zhǔn)確的測(cè)序技術(shù)問世， 進(jìn)一步推動(dòng)測(cè)序平臺(tái)在病原體檢測(cè)方面的應(yīng)用。盡管納米孔測(cè)序技術(shù)已將高通量測(cè)序的單次運(yùn)行成本由數(shù)萬(wàn)元降至不足1萬(wàn)元，但對(duì)于臨床應(yīng)用而言檢測(cè)成本仍然較高，因此，目前的測(cè)序平臺(tái)難以實(shí)現(xiàn)低成本快速檢測(cè)SARS-CoV-2，未能在此次疫情防控中廣泛使用，但在SARS-CoV-2變異、溯源與機(jī)制研究中依然具有不可替代的地位。

2.2 基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

與高通量測(cè)序平臺(tái)相比，實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)憑借一臺(tái)小巧的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)已知序列靶標(biāo)核酸的高靈敏定量檢測(cè)，因其穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)便，成為目前應(yīng)用最廣的核酸檢測(cè)平臺(tái)。疫情爆發(fā)的第一時(shí)間，各大科研機(jī)構(gòu)和公司根據(jù)SARS-CoV-2基因序列研制了基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)方法與試劑盒。這些方法多基于熒光標(biāo)記探針對(duì)擴(kuò)增的靶核酸進(jìn)行檢測(cè)，其基本原理(圖2)是通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒由RNA序列反轉(zhuǎn)錄為DNA序列，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程; 在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的靶標(biāo)特異性Taqman探針與靶標(biāo)序列雜交時(shí)，標(biāo)記的熒光基團(tuán)會(huì)被DNA聚合酶的核酸外切酶活性切割，產(chǎn)生熒光信號(hào)，每個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)被儀器記錄下來(lái)，形成擴(kuò)增曲線，根據(jù)CT值可對(duì)待測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)[21]。目前，基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒多根據(jù)病毒基因組中的開放閱讀框1a/b(Opening reading frame 1ab， ORF1ab)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein， N)和包膜蛋白(Envelope protein， E)基因設(shè)計(jì)引物與探針[22]，檢測(cè)靈敏度在200～1000 copies/mL范圍內(nèi)。

圖2 RT-PCR檢測(cè)原理(Taqman探針法)Fig.2 Principle of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR,Taqman probe technology)

實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)均擁有相關(guān)儀器設(shè)備，因此，是SARS-CoV-2核酸檢測(cè)所使用的主要技術(shù)平臺(tái)。然而，傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的樣本核酸提取與擴(kuò)增檢測(cè)需分開進(jìn)行，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件和操作人員要求較高，依賴熒光定量PCR儀，檢測(cè)時(shí)間需要2～4 h，不利于現(xiàn)場(chǎng)篩查和資源匱乏地區(qū)使用。此外，對(duì)于病毒核酸含量低至單拷貝數(shù)量級(jí)的樣本，其檢測(cè)靈敏度還不夠高，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，且受熒光標(biāo)記種類的限制，其檢測(cè)靶標(biāo)數(shù)目有限，難以實(shí)現(xiàn)多重組合篩查。

2.3 基于數(shù)字化平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

基于實(shí)時(shí)熒光PCR的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)存在弱陽(yáng)性、假陰性結(jié)果的原因除了樣本儲(chǔ)存或提取外，檢測(cè)方法本身靈敏度不夠高也是重要因素。當(dāng)病毒載量較低時(shí)，單個(gè)反應(yīng)中有效病毒核酸可能只有單拷貝數(shù)量級(jí)，需要具有單分子檢測(cè)能力的技術(shù)才能減少假陰性結(jié)果。數(shù)字化核酸檢測(cè)平臺(tái)是一種能對(duì)靶標(biāo)分子直接計(jì)數(shù)的平臺(tái)[23]，它利用微液滴生成系統(tǒng)或微反應(yīng)單元陣列芯片，將核酸擴(kuò)增檢測(cè)體系(通常為PCR)分成上萬(wàn)個(gè)均勻的微小反應(yīng)單元(圖3)，每個(gè)反應(yīng)單元中只有單個(gè)或零個(gè)靶標(biāo)核酸分子，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的陰陽(yáng)性計(jì)數(shù)，根據(jù)泊松分布原理即可獲得起始靶標(biāo)核酸的絕對(duì)濃度。因此，基于數(shù)字化平臺(tái)的核酸檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確測(cè)定起始濃度低至單拷貝的靶標(biāo)核酸，解決了SARS-CoV-2檢測(cè)因病毒載量低而產(chǎn)生的假陰性問題。

圖3 數(shù)字化PCR檢測(cè)原理Fig.3 Principle of digital PCR

目前，已用于SARS-CoV-2檢測(cè)的數(shù)字化平臺(tái)主要為基于自動(dòng)化微滴芯片的數(shù)字PCR技術(shù)。在體系中加入RNA模板后，經(jīng)一步反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，通過(guò)3種熒光標(biāo)記探針分別在每個(gè)反應(yīng)單元中報(bào)告SARS-CoV-2的ORF1ab基因、N基因及內(nèi)控基因擴(kuò)增產(chǎn)物，最終通過(guò)計(jì)算陽(yáng)性微液滴的數(shù)目，可在2.5 h內(nèi)對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行高靈敏、高特異檢測(cè)。有研究比較了微液滴數(shù)字化PCR(ddPCR)和實(shí)時(shí)RT-PCR(兩種方法的靶基因均為ORF1ab基因和N基因)對(duì)323例新冠病毒感染患者樣本的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)高病毒載量的95例樣本兩種方法一致性為100%，而低病毒載量的樣本中存在不一致的檢測(cè)結(jié)果，其中67例RT-PCR檢測(cè)為單基因陽(yáng)性的樣本中有41例ddPCR檢測(cè)為雙基因陽(yáng)性，161例RT-PCR檢測(cè)為陰性的樣本中有4例ddPCR檢測(cè)為陽(yáng)性，這些RT-PCR檢測(cè)為假陰性的樣本經(jīng)ddPCR顯示病毒絕對(duì)量為11.1～123.2 copies[24]，表明數(shù)字化PCR技術(shù)用于SARS-CoV-2檢測(cè)更靈敏。此外，由于數(shù)字化PCR技術(shù)定量分析性能更好，可用于疾病發(fā)展不同階段的SARS-CoV-2含量監(jiān)測(cè), 進(jìn)而對(duì)病情進(jìn)行評(píng)估。

盡管數(shù)字化平臺(tái)在檢測(cè)靈敏度和定量性能方面優(yōu)于其它平臺(tái)，但數(shù)字化檢測(cè)平臺(tái)的儀器設(shè)備較昂貴，檢測(cè)通量有限，不適于對(duì)大量樣本進(jìn)行檢測(cè)。此外，受限于熒光檢測(cè)通道，該平臺(tái)難以對(duì)多靶標(biāo)進(jìn)行多重檢測(cè)。

2.4 基于核酸質(zhì)譜平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

核酸質(zhì)譜平臺(tái)采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)對(duì)核酸片段進(jìn)行分析[25,26]，常見的檢測(cè)原理如圖4所示。首先制備核酸樣本并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增富集靶標(biāo)序列，然后與基因特異性引物結(jié)合進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，純化后的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步與芯片基質(zhì)共結(jié)晶, 并在質(zhì)譜儀上檢測(cè)，期間核酸分子將受激光激發(fā)電離為單電荷離子在電場(chǎng)中飛行，由于飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過(guò)檢測(cè)核酸分子在質(zhì)譜儀真空管中的飛行時(shí)間可以直接獲知其分子量，從而分析出待測(cè)基因信息。

圖4 核酸質(zhì)譜法檢測(cè)原理Fig.4 Principle of mass spectrometry for nucleic acid analysisMALDI-TOF-MS, matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry.

在中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會(huì)發(fā)布的第二批新冠肺炎疫情防治急需醫(yī)學(xué)裝備目錄中， Clin-ToF I飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、Clin-ToF II飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等入選，表明核酸質(zhì)譜平臺(tái)也可用于SARS-CoV-2的檢測(cè)。

核酸質(zhì)譜最大的優(yōu)勢(shì)在于可區(qū)分僅有單個(gè)堿基序列差異的寡核苷酸片段，這使多重檢測(cè)無(wú)需熒光標(biāo)記，僅通過(guò)質(zhì)量標(biāo)簽即可實(shí)現(xiàn)，因此檢測(cè)試劑的成本更低，檢測(cè)通量更高。然而，運(yùn)用核酸質(zhì)譜平臺(tái)檢測(cè)靶標(biāo)核酸，需經(jīng)歷樣本前處理、PCR產(chǎn)物制備、產(chǎn)物純化和質(zhì)譜分析等多個(gè)步驟，操作繁瑣，且樣本處理要求高，MALDI不同的基質(zhì)成分也會(huì)直接影響信號(hào)的檢測(cè)。

2.5 基于紙基分析平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

紙基分析平臺(tái)是一類在紙上完成生物化學(xué)分析的檢測(cè)平臺(tái)[27]，常見的為試紙條技術(shù)[28]，降低了對(duì)儀器設(shè)備的依賴。通常，紙基分析平臺(tái)與核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)偶聯(lián)以進(jìn)一步降低對(duì)儀器設(shè)備的依賴，如基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification， LAMP)的試紙條[29]、基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification， RPA)的試紙條[30]等。以LAMP反應(yīng)為例，常見的試紙條檢測(cè)原理如圖5所示，63℃(60℃～65℃)恒定溫度下，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，并在3對(duì)LAMP引物(F3-B3、FIP-BIP和LF-LB)和具有鏈置換活性的Bst聚合酶作用下，生成大量帶標(biāo)記的靶標(biāo)LAMP產(chǎn)物; 隨后將產(chǎn)物加入試紙條的樣品墊，在緩沖液作用下層析移動(dòng)，并與結(jié)合墊處修飾的膠體金作用。由于結(jié)合墊處的膠體金修飾有抗體和鏈霉親和素，當(dāng)存在靶標(biāo)序列時(shí)，發(fā)生免疫親和作用，試紙條上檢測(cè)線和質(zhì)控線位置均會(huì)出現(xiàn)肉眼可見的有色條帶； 而無(wú)靶標(biāo)時(shí)， 只有質(zhì)控線位置出現(xiàn)有色條帶。 因此，通過(guò)肉眼觀察可直接判斷陰陽(yáng)性。

圖5 基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)試紙條的檢測(cè)原理Fig.5 Detection principle of test strip based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP)

2017年出現(xiàn)的基于Cas13與RPA擴(kuò)增偶聯(lián)的SHERLOCK技術(shù)[31]已被用于檢測(cè)SARS-CoV-2，該方法設(shè)計(jì)了特異性檢測(cè)病毒刺突蛋白(Spike protein，S)基因和ORF1ab基因的核酸試紙條，1 h內(nèi)可完成檢測(cè)，靈敏度低至10～100 copies/μL[32]。此外，有研究報(bào)道將Cas12與RT-LAMP(反轉(zhuǎn)錄LAMP)偶聯(lián)，建立了基于試紙條可視化檢測(cè)SARS-CoV-2的方法，可在45 min內(nèi)檢測(cè)濃度低至10 copies/μL的RNA提取物[33]，為SARS-CoV-2現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)產(chǎn)品的開發(fā)提供了思路。

基于紙基分析平臺(tái)的SARS-CoV-2檢測(cè)技術(shù)采用恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，不需要精密儀器，擴(kuò)增速度快，將擴(kuò)增產(chǎn)物加到試紙條上或?qū)⒃嚰垪l插入結(jié)束后的反應(yīng)體系中即可顯示結(jié)果，無(wú)需依賴專業(yè)分析設(shè)備，通過(guò)觀察顏色，肉眼可直接判斷有無(wú)靶標(biāo)病毒，因此操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，能滿足即時(shí)檢測(cè)的需求，特別適合實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)陋地區(qū)或應(yīng)急情況下的病原體核酸檢測(cè)。然而，以試紙條為代表的紙基分析平臺(tái)尚未兼容SARS-CoV-2的提取和純化操作，檢測(cè)反應(yīng)仍需在管內(nèi)進(jìn)行，需要開管進(jìn)行試紙條顯色反應(yīng)，存在產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外，紙基分析平臺(tái)檢測(cè)通量低，多數(shù)方法無(wú)法定量分析，因此只能用于病原體核酸的低通量定性檢測(cè)。

2.6 基于微流控平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的生化檢測(cè)方法包括樣本制備、試劑處理、生化反應(yīng)發(fā)生和檢測(cè)多個(gè)階段，而微流控平臺(tái)則能將傳統(tǒng)的多步或全部操作整合到一個(gè)小型平臺(tái)上。如在紙基平臺(tái)片上發(fā)展出的微流控平臺(tái)檢測(cè)技術(shù)，即紙芯片技術(shù)[34]，樣本的核酸提取與檢測(cè)操作均整合在紙基芯片上，通過(guò)折紙工藝或紙制移動(dòng)閥操縱反應(yīng)的進(jìn)行[35, 36]。然而，紙芯片技術(shù)人工操作多、靈活性差，仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，尚未用于SARS-CoV-2的檢測(cè)。目前，發(fā)展較為成熟的微流控平臺(tái)通常以具有良好的光學(xué)透明性、電絕緣性及反應(yīng)惰性的材料(石英、聚二甲基硅氧烷等)加工制成的微流控芯片技術(shù)為主，大小僅為幾平方厘米，利用微通道、微泵、微型進(jìn)樣閥和微型出口等裝置構(gòu)成允許少量液體流動(dòng)的自動(dòng)操縱系統(tǒng)[37]，達(dá)到了快速、高效、準(zhǔn)確地分析檢測(cè)樣本的目的。由于微流控平臺(tái)配套的儀器體型小，質(zhì)量輕便，因此，特別適合醫(yī)療資源缺乏地區(qū)檢測(cè)項(xiàng)目的開展，助力病原體的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查和檢測(cè)。

博奧晶典生物公司開發(fā)了六項(xiàng)呼吸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒 (恒溫?cái)U(kuò)增芯片法)，配合該公司的恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀，在簡(jiǎn)單的樣本核酸提取后，混合核酸擴(kuò)增試劑即可上樣芯片， 在微流控平臺(tái)自動(dòng)進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，1.5 h內(nèi)完成包括SARS-CoV-2在內(nèi)6種呼吸道病毒的檢測(cè)，對(duì)SARS-CoV-2能達(dá)到每反應(yīng)檢測(cè)15 copies病毒分子的靈敏度，為新冠疫情防控工作提供了高效的檢測(cè)工具。

基于微流控芯片平臺(tái)的SARS-CoV-2檢測(cè)技術(shù)將樣本檢測(cè)的多步反應(yīng)集成在了體積微小的芯片上，對(duì)檢測(cè)試劑和樣本的需求量都大大減少，且反應(yīng)速度快、自動(dòng)化程度高，通過(guò)精巧的芯片設(shè)計(jì)提高了核酸檢測(cè)通量。然而，目前多數(shù)商品化微流控芯片平臺(tái)仍無(wú)法兼容樣本核酸提取的步驟，尚未實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的核酸檢測(cè)目標(biāo)。此外，芯片的設(shè)計(jì)和制作成本較高，有待進(jìn)一步優(yōu)化方案， 降低檢測(cè)成本。

2.7 基于整合型自動(dòng)化平臺(tái)的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)

在不同核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)中，核酸提取操作是實(shí)現(xiàn)病原體準(zhǔn)確檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)。常規(guī)的核酸提取分為手動(dòng)提取和儀器自動(dòng)化提取兩種方式，但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中均需人工將提取產(chǎn)物加入檢測(cè)體系，當(dāng)處理含傳染性較強(qiáng)的病毒樣本時(shí), 會(huì)增加實(shí)驗(yàn)人員的感染風(fēng)險(xiǎn)。為了避免單獨(dú)進(jìn)行樣本核酸提取操作產(chǎn)生的問題，整合型自動(dòng)化核酸檢測(cè)平臺(tái)應(yīng)運(yùn)而生，這是一類集樣本提取、核酸檢測(cè)和結(jié)果輸出于一體的封閉式自動(dòng)化核酸檢測(cè)系統(tǒng)，既可避免過(guò)多的人工操作帶來(lái)的誤差和生物安全問題，也可避免樣本檢測(cè)時(shí)的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

第一個(gè)整合型自動(dòng)化分析平臺(tái)為GeneXpert快速檢測(cè)系統(tǒng)，其核心為一臺(tái)能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)樣品制備和檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。只需在系統(tǒng)配套的封閉式卡盒中加入采集的原始樣本，儀器裝載卡盒后, 將自動(dòng)完成樣本裂解、核酸提取、定量PCR檢測(cè)等一系列操作，并輸出反應(yīng)結(jié)束后的分析結(jié)果，達(dá)到 “Sample in-Anwser out”(樣本進(jìn)-結(jié)果出)的效果。目前已開發(fā)出基于GeneXpert快速檢測(cè)系統(tǒng)的新產(chǎn)品Xpert?Xpress SARS-CoV-2，可在45 min內(nèi)完成樣本的定性檢測(cè)，大大提高了SARS-CoV-2的檢測(cè)效率。然而, GeneXpert平臺(tái)的研發(fā)主要基于PCR類方法[38]，這類方法需要熱循環(huán)過(guò)程，對(duì)溫控要求高，因此儀器價(jià)格昂貴; 此外，該平臺(tái)試劑耗材成本也較高，不適于臨床推廣。因此，發(fā)展恒溫條件下的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)將有利于自動(dòng)化檢測(cè)儀器的成本控制，進(jìn)而降低臨床樣本的檢測(cè)成本。RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Simultaneous amplification and testing, SAT)是一種RNA檢測(cè)新技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄將T7啟動(dòng)子引入cDNA中，生成DNA雙鏈后，再由T7 RNA聚合酶催化反應(yīng)生成多個(gè)含靶標(biāo)序列的RNA分子，隨后進(jìn)入下一輪RNA逆轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄循環(huán)，全程由能結(jié)合靶標(biāo)RNA的分子信標(biāo)實(shí)時(shí)報(bào)告檢測(cè)信號(hào)，整個(gè)反應(yīng)在42 ℃ 進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了恒溫條件下RNA靶標(biāo)的高效擴(kuò)增與檢測(cè)[39]。2020年3月， 上海仁度生物公司基于全自動(dòng)SAT核酸分析系統(tǒng)(AutoSAT)成功開發(fā)了全自動(dòng)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了“樣本進(jìn)-結(jié)果出”的封閉式自動(dòng)化檢測(cè)，可對(duì)單個(gè)樣本或批量樣本進(jìn)行處理，第一個(gè)樣本從進(jìn)樣到出報(bào)告時(shí)間為90 min，24 h內(nèi)可完成700個(gè)樣本的批量檢測(cè)。

基于整合型自動(dòng)化平臺(tái)的SARS-CoV-2檢測(cè)技術(shù)將樣本提取、核酸檢測(cè)與結(jié)果輸出整合在一套系統(tǒng)內(nèi)，達(dá)到了“樣本進(jìn)-結(jié)果出”式全自動(dòng)檢測(cè)病原體核酸的目的，該平臺(tái)無(wú)需專業(yè)的實(shí)驗(yàn)操作人員和嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，儀器便攜，且檢測(cè)效率高、重復(fù)性好，因此特別適合病原體現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。然而，目前整合型自動(dòng)化平臺(tái)仍處在發(fā)展階段，儀器和耗材的價(jià)格較高，多數(shù)儀器單次運(yùn)行的檢測(cè)通量較低，因此，在臨床推廣前尚有較大的發(fā)展空間。

上述技術(shù)平臺(tái)在核酸檢測(cè)方面具有各自的優(yōu)勢(shì)與不足(表1)，因此，在應(yīng)用這些技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2時(shí)，需根據(jù)實(shí)際情況選擇技術(shù)平臺(tái)。如在資源緊張的應(yīng)急情況下，適合選用紙基分析平臺(tái)和微流控平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查; 當(dāng)樣本提取獲得的核酸濃度較低或常規(guī)檢測(cè)結(jié)果呈弱陽(yáng)性時(shí)，適合選用數(shù)字化平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)低病毒載量樣本的準(zhǔn)確檢測(cè)。

3 結(jié)論與展望

目前，世界范圍內(nèi)COVID-19的確診人數(shù)仍在增加，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)也在不斷發(fā)展。本文從核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)出發(fā)，介紹了SARS-CoV-2的主要檢測(cè)技術(shù)，由于不同技術(shù)平臺(tái)在核酸檢測(cè)方面具有各自的優(yōu)勢(shì)與不足，在實(shí)際應(yīng)用中需根據(jù)實(shí)際情況和具體要求選擇檢測(cè)方法。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，具有檢測(cè)快速、成本低廉、不依賴大型設(shè)備等優(yōu)勢(shì)的POCT(Point-of-care testing)類技術(shù)，在對(duì)SARS-CoV-2檢測(cè)時(shí)， 也暴露出安全性不足、靈敏度低等問題。為了應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2等具有傳染性強(qiáng)、 潛伏期長(zhǎng)等特點(diǎn)的惡性病毒， 核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的后續(xù)發(fā)展需重視兩點(diǎn)：檢測(cè)方法需特異性好、靈敏度高、反應(yīng)速度快; 儀器設(shè)備需人工操作少、通量高、制造成本低且更為便攜?，F(xiàn)有的全自動(dòng)一體化SARS-CoV-2檢測(cè)平臺(tái)通量較低，多數(shù)平臺(tái)只能通過(guò)并行運(yùn)行多臺(tái)儀器設(shè)備提高檢測(cè)通量，無(wú)疑增加了儀器設(shè)備的成本。因此，發(fā)展高通量、全自動(dòng)病原體檢測(cè)平臺(tái)是今后發(fā)展的趨勢(shì)與面臨的挑戰(zhàn)。

表1 常見SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)的比較