王舒越 賈勝男 李瀟影 張海洋 馮 馨 王 詩 陶緯國(guó),4 胡良海*

1(吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130023) 2(吉林大學(xué)第二醫(yī)院, 長(zhǎng)春 130041) 3(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 南京210096) 4(Purdue University, West Lafayette, IN 47907)

1 引 言

外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑在40～160 nm之間的具有磷脂雙分子層的胞外囊泡, 在許多生理進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用, 如信號(hào)傳導(dǎo)、抗原反應(yīng)和免疫應(yīng)答等[1～5]。外泌體蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6], 而且許多外泌體表面蛋白以及標(biāo)志物蛋白均為糖蛋白[7～9]。因此, 深入研究外泌體蛋白的糖基化修飾具有十分重要的意義。

尿液是最為常見的臨床生物體液, 可以無創(chuàng)傷地大量獲取, 并且含有對(duì)腎臟、膀胱、尿道以及前列腺等疾病具有潛在診斷價(jià)值的外泌體, 因此, 近年來對(duì)尿液外泌體的研究逐漸增多。隨著對(duì)尿液外泌體研究的深入, 外泌體提取技術(shù)也得到了迅速發(fā)展[10～12], 如利用外泌體與其它組成成分的密度差異而發(fā)展的超速離心提取外泌體的方法, 被視為外泌體提取的黃金標(biāo)準(zhǔn)。 Principe等[13]利用超速離心法提取前列腺癌患者尿液外泌體, 并成功鑒定到約900種蛋白質(zhì)。然而, 這種方法需要對(duì)大量尿液進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間離心, 且難以實(shí)現(xiàn)與外泌體具有相近密度的蛋白聚合體等其它生物大分子的有效分離, 限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。常用的方法還有基于聚合物將外泌體沉淀的沉淀法(如ExoQuick-TC), 此方法操作簡(jiǎn)便、快速, 外泌體的提取效率高。Alvarez等[14]對(duì)比了超速離心法和沉淀法提取尿液外泌體中蛋白質(zhì)和mRNA的提取效果, 發(fā)現(xiàn)沉淀法提取mRNA和外泌體時(shí)比超速離心法的效果更好; 但沉淀法提取蛋白質(zhì)時(shí), 效果略差, 還需借助體積排阻法進(jìn)一步提取。體積排阻法也可實(shí)現(xiàn)外泌體無損分離, 但長(zhǎng)時(shí)間的分離需要對(duì)液相色譜進(jìn)行充分的洗脫和平衡, 限制了體積排阻法在外泌體分離方面的高通量應(yīng)用[15]。此外, 還有利用外泌體表面的特異性蛋白(如CD9和CD63等)進(jìn)行外泌體提取的免疫法, 雖然這種方法可以高純度提取外泌體, 但其價(jià)格昂貴, 難以廣泛使用。盡管尿液外泌體的提取技術(shù)有了一定的發(fā)展, 然而外泌體糖基化蛋白質(zhì)組的研究進(jìn)展還十分有限。早期對(duì)外泌體糖基化的研究主要局限于切除糖鏈后對(duì)修飾肽段和蛋白質(zhì)的研究, 損失了完整糖鏈的信息。2015年, Saraswat等[16]利用超速離心法提取尿液中的外泌體, 從800 mL尿液中提取到來自37種糖蛋白的126條N-糖基化肽段和51個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 首次實(shí)現(xiàn)了尿液外泌體糖基化蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)性分析研究。2018年, Bai等[17]利用肼修飾的熱敏性聚合物從人源血漿樣品中富集出180種N-糖蛋白對(duì)應(yīng)329個(gè)位點(diǎn)。2019年, Belczacka等[18]從238名健康人和969名患者(分別患有膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、膽管癌和腎細(xì)胞癌)的尿液中提取外泌體, 并進(jìn)行糖基化分析, 最終在健康人尿液樣本中鑒定到37條完整O-糖基化肽段和23條完整N-糖基化肽段, 并通過對(duì)不同癌癥樣品與健康樣品之間的糖基化肽段進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn), 有3條O-糖基化肽段和5條N-糖基化肽段的豐度變化十分顯著。然而, 由于尿液外泌體中糖肽豐度低且缺乏有效的分析方法, 因此, 即使加大樣本量也難以實(shí)現(xiàn)對(duì)其有效富集和鑒定, 更難深入研究。因此, 亟需發(fā)展更完善的尿液外泌體糖基化蛋白質(zhì)組的研究方法。

本研究發(fā)展了一種基于外泌體的親脂性和糖肽的親水性的尿液外泌體糖基化的研究方法。EVTRAP磁珠[19]是一種表面修飾脂膜的磁珠, 基于其與外泌體的磷脂雙分子層之間的疏水親脂作用, 可實(shí)現(xiàn)對(duì)尿液外泌體的提取。實(shí)驗(yàn)表明, 利用EVTRAP磁珠可以從200 μL尿液樣品中提取外泌體, 并鑒定到來自2000種蛋白質(zhì)的超過16000條非冗余肽段。此方法操作簡(jiǎn)便, 可以從少量尿液中高效提取出外泌體, 實(shí)現(xiàn)對(duì)尿液外泌體蛋白質(zhì)的高通量鑒定分析, 是一種非常適合并能有效提取尿液外泌體的材料。點(diǎn)擊麥芽糖材料[20]是一種利用點(diǎn)擊化學(xué)將麥芽糖修飾在硅球上的材料, 因其表面具有豐富的羥基基團(tuán)而具有良好的親水性。相比于其它材料, 如瓊脂糖僅可從人源免疫球蛋白酶解液中富集到13條相對(duì)高豐度的糖肽, 點(diǎn)擊麥芽糖材料可以進(jìn)行親水色譜法富集并捕獲到27條糖肽, 具有良好的親水富集效果, 可富集低豐度的糖肽。因此, 本研究利用EVTRAP磁珠與外泌體的磷脂雙分子層之間的疏水親脂作用, 可有效地將外泌體從尿液樣品中提取出來, 經(jīng)過裂解和酶解處理后, 利用具有良好親水相互作用的點(diǎn)擊麥芽糖材料與糖肽的糖鏈之間的親水作用, 有效富集外泌體中的糖肽, 結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)尿液外泌體蛋白酶解液和糖肽樣品進(jìn)行檢測(cè)鑒定, 成功實(shí)現(xiàn)了尿液的外泌體糖基化鑒定的規(guī)?；治觥?/p>

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

U3000 RSLC納升流速液相色譜儀和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司); 胞內(nèi)賴氨酸蛋白酶(Lys C)購自美國(guó)Thermo公司; 胰蛋白酶(Trypsin)、三乙胺(TEA)、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、脫氧膽酸鈉(SDC)、月桂?；彼徕c(SLS)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、氯乙酸(CAA)、四乙基硼氫化銨(TEAB)、乙酸乙酯(EA), 均購自美國(guó)Sigma公司;N-糖酰胺酶F(PNGase F, 美國(guó)New England Biolabs公司)。C18膜(美國(guó)3M公司); EVTRAP磁珠(美國(guó)Tymora公司); 親水材料點(diǎn)擊麥芽糖材料來自大連化學(xué)物理研究所梁鑫淼課題組。樣品制備實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。液相色譜使用的乙腈(質(zhì)譜級(jí))和純水購自美國(guó)Thermo公司。尿液樣品由本實(shí)驗(yàn)室健康實(shí)驗(yàn)人員授權(quán)提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 外泌體提取與蛋白質(zhì)酶解收集30 mL健康成人尿液, 以2500 g離心10 min, 去除尿液中的雜質(zhì)和細(xì)胞成分。然后, 加入1 mL 0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚-乙基苯基聚乙二醇, 渦旋均勻后, 加入450 mL EVTRAP磁珠, 室溫條件下翻轉(zhuǎn)孵育1 h。磁性分離, 用1 mL 磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制的0.01% 聚乙二醇辛基苯基醚-乙基苯基聚乙二醇溶液洗滌1次, 用磷酸鹽緩沖液洗3次, 最后用200 mL新鮮配制的100 mmol/L 三乙胺渦旋10 min充分洗脫兩次, 收集洗脫液,凍干。將凍干樣品復(fù)溶于100 mL裂解液(12 mmol/L 脫氧膽酸鈉,12 mmol/L 月桂?；彼徕c,10 mmol/L 三(2-羧乙基)膦,40 mmol/L 氯乙酸, 50 mmol/L 三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 8.0))中, 混合均勻后, 95℃水浴10 min, 冷卻至室溫, 加入5倍體積的50 mmol/L 四乙基硼氫化銨溶液稀釋, 然后按酶與蛋白質(zhì)量比1∶100加入胞內(nèi)賴氨酸蛋白酶, 37℃酶解反應(yīng)3 h, 按酶與蛋白的質(zhì)量比為1∶50補(bǔ)加胰蛋白酶, 37℃繼續(xù)酶解16 h。酶解結(jié)束后, 加入10% 三氟乙酸使其終濃度為1%。向體系中加入等體積的乙酸乙酯, 渦旋2 min后,以17000 g離心3 min, 去除上層乙酸乙酯溶液, 重復(fù)洗滌兩次, 以去除體系中的表面活性劑, 然后凍干, 使用C18膜填充的除鹽小柱進(jìn)行除鹽。除鹽后的洗脫液保留100 mL, 冷凍干燥后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè), 余下部分經(jīng)冷凍干燥后, 于-20℃保存, 待糖肽富集。

2.2.2 外泌體糖基化肽段富集使用點(diǎn)擊麥芽糖親水材料對(duì)外泌體樣品進(jìn)行糖肽富集。首先, 將凍干樣品復(fù)溶于200 mL上樣溶液(三氟乙酸-乙腈-水(1∶80∶19，V/V))中, 將點(diǎn)擊麥芽糖材料用上樣液充分分散平衡, 超聲15 min后, 離心, 棄溶液, 將樣品與富集材料混合, 終體積為200 mL, 室溫條件下, 1500 r/min振蕩孵育1 h。孵育結(jié)束后, 將體系轉(zhuǎn)移至1 mm聚四氟乙烯篩板封端的小柱中, 控制離心轉(zhuǎn)速上樣10 min。然后用淋洗液(三氟乙酸-乙腈-水(1∶80∶19，V/V))洗去非特異性吸附肽段。洗滌過程控制時(shí)間同上樣要求。最后, 用洗脫液(三氟乙酸-乙腈-水(1∶30∶69，V/V))控制轉(zhuǎn)速離心洗脫20 min。將洗脫液冷凍干燥, 于-20℃保存, 待用。

2.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析在U3000 RSLC納升流速液相色譜-Lumos質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)上進(jìn)行。將樣品復(fù)溶于甲酸-乙腈-水(0．1∶2∶97．9，V/V)溶液中, 然后通過上樣到填充C18AQ微球(粒徑1.9 mm)的分析柱(長(zhǎng)15 cm, 內(nèi)徑150 μm)上。流動(dòng)相A為甲酸-乙腈-水(0.1∶2∶97.9，V/V)溶液, 流動(dòng)相B為甲酸-乙腈-水(0.1∶80∶19.9，V/V)溶液。外泌體樣品全蛋白分析先以1% B 等度洗脫10 min后, 再進(jìn)行梯度洗脫(0～3 min, 1%～4% B; 3～63 min, 4%～34% B; 63～75 min, 34%～47% B; 75～78 min, 47～90% B; 78～90 min, 90% B)。 質(zhì)譜采集一級(jí)譜質(zhì)量窗口為m/z350～1800, 分辨率為240000, 二級(jí)譜隔離窗口為m/z0.7。外泌體樣品糖基化分析時(shí), 樣品經(jīng)過9 min等梯度上樣后, 再進(jìn)行梯度洗脫(0～3 min, 1%～4% B; 3～63 min, 4%～34% B; 63～75 min, 34%～47% B; 75～80 min, 47%～90% B; 80～90 min, 90% B)。一級(jí)譜質(zhì)量窗口為m/z350～1500, 分辨率為120000, 二級(jí)譜隔離窗口為m/z1.6, 二級(jí)碎裂采用階梯碎裂能量模式, 3個(gè)階梯的歸一化碎裂能量為22%、27%和32%。

2.2.4 數(shù)據(jù)檢索與分析質(zhì)譜檢測(cè)得到的外泌體全蛋白樣品數(shù)據(jù)的原始文件使用Proteome Discover(2.2版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。使用的數(shù)據(jù)庫為UniProt網(wǎng)站(http://www.uniprot.org)上下載的人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(27156種蛋白質(zhì), 2019), 數(shù)據(jù)檢索的參數(shù)設(shè)置為：母離子質(zhì)量窗口為10 ppm, 子離子質(zhì)量窗口為0.02 Da, 設(shè)定為胰蛋白酶酶切, 漏切位點(diǎn)最多為2個(gè), 半胱氨酸烷基化(+57.0215 Da)為固定修飾, 甲硫氨酸氧化(+15.9949 Da)為可變修飾, 分別控制肽段和蛋白層次上的結(jié)果的假陽性率(False positive rate, FDR)不超過1%。質(zhì)譜檢測(cè)得到的外泌體糖基化肽段樣品數(shù)據(jù)的原始文件使用pGlyco(2.2版本)進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索。使用數(shù)據(jù)庫為從UniProt網(wǎng)站上下載的人源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(27156種蛋白質(zhì), 2019), 數(shù)據(jù)檢索的參數(shù)設(shè)置為：母離子質(zhì)量窗口為5 ppm, 子離子質(zhì)量窗口為20 ppm, 設(shè)置為胰蛋白酶酶切, 漏切位點(diǎn)最多為2個(gè), 半胱氨酸烷基化(+57.0215 Da)為固定修飾, 甲硫氨酸氧化(+15.9949 Da)為可變修飾。檢索完成后導(dǎo)出的數(shù)據(jù)設(shè)置總體FDR不超過1%。

3 結(jié)果與討論

圖1 尿液外泌體糖基化修飾分析流程Fig.1 Workflow of urine exosome glycosylation analysis

尿液外泌體糖基化修飾分析的流程如圖1所示。 首先, 利用外泌體的磷脂雙分子層， 使用EVTRAP磁珠將外泌體從尿液中富集出來; 然后, 將外泌體進(jìn)行裂解和酶解; 再利用糖基化肽段的親水特性, 使用點(diǎn)擊麥芽糖材料將糖肽從蛋白質(zhì)酶解液中富集出來; 最后, 結(jié)合LC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè), 獲得尿液外泌體全蛋白組成及其糖基化修飾的表達(dá)譜。

3.1 尿液外泌體提取的蛋白質(zhì)組學(xué)評(píng)價(jià)

首先對(duì)EVTRAP磁珠提取人源尿液中的外泌體效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。將30 mL人源尿液經(jīng)過低速離心去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)后, 使用EVTRAP磁珠進(jìn)行富集, 并進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)酶解, 利用質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè), 共鑒定到1925種非冗余的蛋白質(zhì), 對(duì)應(yīng)14233條非冗余肽段,說明EVTRAP磁珠可實(shí)現(xiàn)對(duì)尿液外泌體的規(guī)模化提取。將EVTRAP磁珠提取到的外泌體蛋白質(zhì)與ExoCarta數(shù)據(jù)庫(http://www.exocarta.org)中外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比(圖2)發(fā)現(xiàn), EVTRAP磁珠提取的外泌體蛋白超過77%收錄于ExoCarta數(shù)據(jù)庫, 且數(shù)據(jù)庫中最常鑒定到的100種外泌體蛋白中, 90%以上被EVTRAP磁珠提取鑒定到, 說明EVTRAP磁珠有效實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模且高效的尿液中外泌體的提取。

圖2 EVTRAP磁珠提取的外泌體蛋白質(zhì)與ExoCarta數(shù)據(jù)庫全部外泌體蛋白和前100種最常鑒定的外泌體蛋白對(duì)比Fig.2 Comparison of exosome proteins extracted by EVTRAP magnetic beads with the total and the top 100 exosome proteins in ExoCarta database

3.2 尿液外泌體糖基化鑒定分析

圖3 外泌體糖基化修飾鑒定結(jié)果Fig.3 Glycosylation identification results of urine exosomes

對(duì)收集到的外泌體蛋白質(zhì)酶解液進(jìn)行糖基化富集。利用點(diǎn)擊麥芽糖材料表面豐富的羥基親水基團(tuán)所具備的親水性[20], 對(duì)尿液外泌體酶解液中的糖肽進(jìn)行親水富集, 將富集到的糖基化肽段通過LC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè), 將質(zhì)譜檢測(cè)文件利用pGlyco軟件進(jìn)行檢索后, 保留假陽性率≤1%的糖肽譜圖, 得到外泌體糖基化修飾的結(jié)果(圖3)。共鑒定到88種非冗余的糖基化蛋白質(zhì), 對(duì)應(yīng)分布于156條肽段骨架序列上的135個(gè)糖基化位點(diǎn)上的95種糖鏈組成, 即468條非冗余的完整糖基化肽段, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)尿液外泌體糖基化蛋組的規(guī)模化鑒定, 驗(yàn)證了利用EVTRAP磁珠和點(diǎn)擊麥芽糖材料結(jié)合兩步提取富集方法在研究尿液外泌體糖基化蛋白質(zhì)組中的有效性。

3.3 糖蛋白生物信息學(xué)分析

通過DAVID(6.8版本)進(jìn)行基因功能(Gene Ontology, GO)注釋分析, 對(duì)獲得的外泌體糖基化蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)和分析(圖4)。首先從細(xì)胞組成上進(jìn)一步驗(yàn)證利用EVTRAP磁珠和點(diǎn)擊麥芽糖材料分析尿液外泌體糖肽方法的有效性, 發(fā)現(xiàn)有>89% 的糖蛋白經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫分類歸屬于外泌體(Extracellular exosome), 說明這種方法確實(shí)可進(jìn)行外泌體糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。另外, 所鑒定到的糖蛋白在分子功能上以肝素結(jié)合(Heparin binding)和絲氨酸類肽段內(nèi)切酶的活性(Serine-type endopeptidase activity,serine-type endopeptidase inhibitor activity)為主,存在與免疫球蛋白受體結(jié)合(Immunoglobulin receptor binding)相關(guān)功能,說明尿液外泌體糖蛋白與多種活性和結(jié)合能力相關(guān)。從生物學(xué)進(jìn)程上, 鑒定到的糖蛋白與血小板脫粒(Platelet degranulation)、受體調(diào)節(jié)的內(nèi)吞作用(Receptor-mediated endocytosis)以及蛋白質(zhì)水解(Proteolysis)相關(guān),并且也與補(bǔ)體激活經(jīng)典通路(Complement activation, classical pathway)和先天免疫應(yīng)答(Innate immune response)有關(guān), 說明尿液外泌體糖蛋白在免疫相關(guān)通路上具有一定的作用。

圖4 外泌體糖基化蛋白質(zhì)的基因功能分析:黃色為生物學(xué)進(jìn)程; 綠色為細(xì)胞組成; 藍(lán)色為分子功能Fig.4 Gene ontology analysis of exosome glycoproteins: molecular function biological process (yellow bar); cellular composition (green bar); molecular function (blue bar)

對(duì)鑒定到的外泌體糖蛋白利用STRING網(wǎng)站(https://string-db.org)進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(Protein-Protein Interaction, PPI)和KEGG富集通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)(圖5)。將相互作用關(guān)系可信度設(shè)置為最高級(jí)0.900, 發(fā)現(xiàn)在這些糖蛋白之間共存在144種相互作用, 具有十分復(fù)雜的相互作用關(guān)系。通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)存在補(bǔ)體系統(tǒng)(Complement and coagulation cascades)、溶酶體(Lysosome)和腎素血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system)通路, 說明尿液外泌體糖蛋白在疾病發(fā)生和調(diào)控方面具有重要作用。同時(shí), 在被鑒定的糖蛋白中, 有36種糖蛋白在疾病標(biāo)志物相關(guān)的研究中鑒定到, 甚至具有作為癌癥等疾病的生物標(biāo)志物的潛力(表1), 說明本方法在研究尿液外泌體糖基化蛋白質(zhì)組方面具有良好的效果, 可為臨床治療提供更多的理論支持。

圖5 尿液外泌體糖基化蛋白的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析PPI和KEGG富集通路分析Fig.5 Protein-protein interaction (PPI) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis of urine exosome glycoproteins

3.4 糖基化修飾分析

基于36種潛在的疾病標(biāo)志物糖蛋白進(jìn)行糖基化修飾分析。首先,利用TMHMM SERVER (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/, 2.0版本)對(duì)這些糖蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domain, TMD)預(yù)測(cè)。如圖6所示, 橫坐標(biāo)為36種潛在疾病標(biāo)志物糖蛋白, 橫坐標(biāo)根據(jù)蛋白名稱依次排列, 縱坐標(biāo)為發(fā)生糖基化修飾的位點(diǎn)距離跨膜結(jié)構(gòu)域的位置, 正數(shù)代表在跨膜域以外, 負(fù)數(shù)代表在跨膜域以內(nèi)。如圖6所示, 這些蛋白的糖基化位點(diǎn)主要發(fā)生在細(xì)胞膜外, 這與糖基化修飾的功能有關(guān)。N-糖基化主要修飾于細(xì)胞膜與細(xì)胞核, 細(xì)胞膜上的糖蛋白大多參與蛋白、小分子結(jié)合以及信號(hào)傳導(dǎo)。

表1 已報(bào)道的潛在疾病標(biāo)志物的文獻(xiàn)中的糖蛋白鑒定情況

這些外泌體糖蛋白的糖基化修飾很可能與遞增的外泌體信號(hào)相關(guān)。其中, 糖蛋白UMOD共鑒定到4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生糖基化, 包括N232、N322、N396和N513, 具有53種不同的糖鏈組成, 其中N232位點(diǎn)糖鏈異質(zhì)性最高, 共有39種糖鏈組成, 這也體現(xiàn)了糖基化修飾的高度異質(zhì)性。

圖6 潛在疾病標(biāo)志物糖蛋白的糖基化位點(diǎn)相對(duì)于跨膜域的位置分布, 糖基化位點(diǎn)：跨膜區(qū)以外(橙色), 跨膜區(qū)以內(nèi)(藍(lán)色) Fig.6 Location of glycosylation sites relative to transmembrane domain of potential disease marker glycoproteins. Glycosylation sites: outside of transmembrane domain (TMD, orange) and inside of TMD (blue)

圖7 糖鏈修飾信息Fig.7 Information of identified glycans

此外, 對(duì)所鑒定到的糖鏈分析發(fā)現(xiàn), 大部分糖鏈發(fā)生了巖藻糖修飾和唾液酸修飾(圖7), 其中同時(shí)發(fā)生巖藻糖修飾和唾液酸修飾的糖鏈占28.4%, 僅發(fā)生巖藻糖修飾的糖鏈占31.6%, 僅發(fā)生唾液酸修飾的糖鏈占23.2%, 說明尿液外泌體中約80%糖鏈具有巖藻糖或唾液酸。此外, 仍有9.5%的糖鏈為高甘露糖型, 并且3.2%的高甘露糖型的糖鏈同時(shí)發(fā)生巖藻糖化。研究表明,蛋白質(zhì)的分子功能受糖鏈的影響, 如發(fā)生核心巖藻糖化修飾的蛋白Hp更能與蛋白Hb形成穩(wěn)定的復(fù)合物; 但發(fā)生巖藻糖化的蛋白AGP則大大降低了與華法林的親和力[28]。尿液外泌體糖基化修飾種類多樣, 說明這些糖基化修飾在多種生理進(jìn)程中具有重要作用。

4 結(jié) 論

利用具有親脂性的EVTRAP磁珠提取尿液外泌體的方法, 從人源尿液中鑒定出1925種非冗余的蛋白質(zhì)以及14233條肽段, 經(jīng)過親水性的點(diǎn)擊麥芽糖材料的富集后, 共獲得來自88種非冗余的糖基化蛋白質(zhì)上的468條完整糖肽, 以及135個(gè)糖基化位點(diǎn)上的95種糖組成, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)人源尿液外泌體糖基化蛋白質(zhì)組的規(guī)?；b定。在完整糖基化肽段層次上分析, 獲得了外泌體糖基化修飾的糖鏈信息, 可為外泌體糖基化修飾的相關(guān)研究提供更有效的實(shí)驗(yàn)方法和更豐富的理論依據(jù)。