鄭萍 徐厚剛 康麗云 王先亮 鄭坤

[摘 要] 隨著我國(guó)生物科技的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅猛，且被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，尤其在植物研究中發(fā)揮了重要作用。分子標(biāo)記技術(shù)不僅能輔助植物選擇育種，提高有效育種率，還能有效提升植物或農(nóng)作物生產(chǎn)率。基于此，本文探究分子標(biāo)記技術(shù)在月季育種中的應(yīng)用，以期推動(dòng)我國(guó)月季育種工作取得良好進(jìn)展，充分發(fā)揮分子標(biāo)記技術(shù)在作物育種方面的優(yōu)勢(shì)，不斷擴(kuò)大分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用范圍。

[關(guān)鍵詞] 分子標(biāo)記;月季;育種

[中圖分類(lèi)號(hào)] S685.12 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-7909（2020）20-83-2

月季是一種薔薇科薔薇屬植物，分布廣泛，在長(zhǎng)期進(jìn)化演變過(guò)程中，受環(huán)境和基因型變異影響，形成了許多基因變型、變種和種間雜種種類(lèi)，這就給月季的育種工作帶來(lái)了較大難度。以往，在不明了月季基因背景的條件下，育種人員多采用雜交等育種技術(shù)進(jìn)行育種，育種效率較低。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)及在遺傳育種或輔助選擇育種方面的廣泛應(yīng)用，為月季育種工作提供了巨大的便利條件。將分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于月季育種工作中，不僅能幫助育種人員了解月季基因DNA多態(tài)性，簡(jiǎn)化性狀基因型鑒定，而且能提高有效育種率，節(jié)省育種所需的人力、物力和時(shí)間。

1 分子標(biāo)記技術(shù)概述

1.1 分子標(biāo)記技術(shù)的概念與分類(lèi)

分子標(biāo)記技術(shù)指的是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，來(lái)直接反映DNA水平遺傳多態(tài)性，從而揭示來(lái)自DNA的變異，根據(jù)分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法。其可以分為四類(lèi)：①基于DNA—DNA雜交的標(biāo)記，包含限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）標(biāo)記技術(shù)和數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性（Variable Number of Tandem Repeats，VNTR）標(biāo)記技術(shù)，其中以RFLP標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其主要是利用特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割不同生物個(gè)體的基因組DNA，將DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況反映出來(lái)[1];②基于PCR的標(biāo)記，主要是采用隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增的DNA區(qū)段產(chǎn)生多態(tài)性，將DNA擴(kuò)增區(qū)段上引物結(jié)合位點(diǎn)的堿基序列的突變反映出來(lái)，主要包含隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD）、任意引物PCR（Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP—PCR）等標(biāo)記技術(shù)：③基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標(biāo)記技術(shù)，包含擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）標(biāo)記技術(shù)和酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences，CAPS）標(biāo)記技術(shù)：④基于單核苷酸的DNA標(biāo)記技術(shù)，如核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標(biāo)記技術(shù)，主要是根據(jù)同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異，對(duì)單個(gè)核苷酸分子水平的差異進(jìn)行檢測(cè)[2]。

1.2 分子標(biāo)記技術(shù)在輔助選擇育種中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)

目前，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于物種親緣關(guān)系鑒別、遺傳育種或輔助選擇育種、基因定位、基因組作圖、基因克隆及基因庫(kù)構(gòu)建等方面，且優(yōu)勢(shì)顯著。其在輔助選擇育種中的應(yīng)用具有以下優(yōu)勢(shì)。一是簡(jiǎn)化性狀基因型鑒定。在進(jìn)行作物育種前需進(jìn)行基因型鑒定，受等位基因?yàn)殡[性等位基因、等位基因外在表現(xiàn)不顯著、等位基因與其他基因存在相互作用等因素的影響，常會(huì)導(dǎo)致基因型鑒定存在一定困難，而采用分子標(biāo)記技術(shù)則能有效簡(jiǎn)化性狀基因型鑒定。主要原因在于分子標(biāo)記技術(shù)的第一代遺傳標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)的等位基因具有共顯性特點(diǎn)，可標(biāo)記多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，檢測(cè)1～4個(gè)基因座位數(shù)，能有效降低基因型鑒定難度[3]。二是提高有效育種率。在傳統(tǒng)的育種過(guò)程中，為獲得優(yōu)良性狀作物，常需早期選擇優(yōu)秀植株進(jìn)行回交，但在實(shí)際育種時(shí)存在較多限制因素，而利用分子標(biāo)記技術(shù)，可在播種后短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)和選擇，不僅能提高有效育種率，而且能節(jié)省育種所需人力、物力和時(shí)間。

2 分子標(biāo)記技術(shù)在月季育種中的具體應(yīng)用

月季是一種薔薇科薔薇屬植物，在世界范圍內(nèi)均有廣泛種植。月季基因組雜合度較高，存在大量多態(tài)性，導(dǎo)致月季種類(lèi)繁多，形態(tài)各異。另外，月季同工酶和形態(tài)特征易受發(fā)育階段和環(huán)境影響，這些因素均給傳統(tǒng)月季育種工作帶來(lái)了較大難度。分子標(biāo)記技術(shù)在月季育種中的應(yīng)用，極大促進(jìn)了月季育種工作的有序開(kāi)展，提高了育種工作效率。目前，分子標(biāo)記技術(shù)在月季育種中的應(yīng)用主要有以下幾方面。

2.1 分子標(biāo)記技術(shù)在月季育種品種鑒定中的應(yīng)用

品種鑒定是月季育種過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，以往育種人員多是根據(jù)月季農(nóng)藝形狀、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)等方法對(duì)月季品種進(jìn)行鑒定分類(lèi)，但受環(huán)境和基因型變異的影響，會(huì)導(dǎo)致月季形態(tài)發(fā)生一定改變，從而限制傳統(tǒng)月季育種品種鑒定方法的應(yīng)用。而分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境變化影響，可確保月季品種鑒定質(zhì)量。目前，可用于月季育種品種鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)有多種，如采用RFLP標(biāo)記技術(shù)可確定月季品種間的親緣關(guān)系，采用基于PCR的標(biāo)記技術(shù)中的隨機(jī)引物可把所有供試月季品種區(qū)別開(kāi)，達(dá)到快速、準(zhǔn)確的品種鑒定效果[4]。

2.2 分子標(biāo)記技術(shù)在月季育種親本選配中的應(yīng)用

親本選配也是月季育種中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)提高月季育種成效率具有直接影響。借助于分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行親本選配，可了解育種品種DNA水平上的多態(tài)性信息，評(píng)判其遺傳多樣性及與選配親本的親緣關(guān)系，能選出最為有效的親本。研究表明，分析月季品種和品種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近最有效的方法為RAPD技術(shù)，采用該標(biāo)記技術(shù)選配月季育種親本，主要是對(duì)月季野生種進(jìn)行RAPD標(biāo)記分析，擴(kuò)增得到RAPD帶，再將其歸類(lèi)到與其遺傳背景分類(lèi)相同的群類(lèi)中。另外，由于部分月季存在無(wú)融合生殖現(xiàn)象，對(duì)這些無(wú)融合植株與其母本遺傳的相似性判定需采用AFLP標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行。

2.3 分子標(biāo)記技術(shù)在輔助月季育種中的應(yīng)用

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)月季的遺傳分子標(biāo)記研究起步較晚，但經(jīng)過(guò)近年來(lái)的努力探究，取得了一定成效。研究指出，利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建一個(gè)月季的高密度遺傳圖譜，利用該遺傳圖譜對(duì)基因之間的相互關(guān)系和明確染色體上基因間的距離，可幫助育種人員選擇最佳的育種基因，從而提高育種質(zhì)量和效率。具體應(yīng)用為，可先采用RAPD、AFLP技術(shù)對(duì)二倍體月季雜交分離群體進(jìn)行標(biāo)記;采用二倍體月季雜交分離群體構(gòu)建月季基因組連鎖圖，利用標(biāo)記結(jié)果對(duì)基因組連鎖圖進(jìn)行補(bǔ)充;利用基因組連鎖圖找到與重要的園藝性狀相連鎖的分子標(biāo)記，如桃紅色花色形狀基因、雙倍花性狀基因、花瓣數(shù)形狀基因和黑斑病抗性形狀基因等，再采用圖位克隆法分離這些基因，構(gòu)建月季BAC文庫(kù)。該文庫(kù)不僅建立了黑斑病抗性基因Rdrl附近的重疊克隆群，而且包含2.5倍個(gè)基因組、15 000個(gè)克隆，能有效幫助育種人員進(jìn)行育種[5]。

3 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)月季分子標(biāo)記研究剛剛起步，由于RAPD技術(shù)具有簡(jiǎn)單、方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，非常適合分析大量群體。因此，目前應(yīng)以RAPD技術(shù)為主通過(guò)與國(guó)外交流，獲得最新月季SSR引物序列后，開(kāi)展SSR技術(shù)研究，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展AFLP與RFLP技術(shù)的應(yīng)用研究。在研究方向上，應(yīng)首先選擇在生產(chǎn)上急需解決的新品種鑒定，知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等問(wèn)題。然后應(yīng)開(kāi)展月季種質(zhì)親緣遺傳關(guān)系、起源、抗性遺傳等特異性狀基因分子標(biāo)記的研究，并最終建立轉(zhuǎn)育特異性狀的分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）系統(tǒng)。我國(guó)作為月季的起源國(guó)，應(yīng)發(fā)展自己特色成果，并在世界月季分子育種領(lǐng)域中占有一席之地。

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