鄭旋 康超 楊玲

摘 ? 要：為探索松乳菇分離培養(yǎng)條件，通過(guò)不同部位組織分離法對(duì)不同培養(yǎng)基進(jìn)行松乳菇分離培養(yǎng)，分析了松乳菇菌柄、菌肉、菌柄與菌肉交界處組織分離的菌絲萌發(fā)和污染情況，以及4種培養(yǎng)基對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，從松乳菇菌柄與菌肉交界處進(jìn)行組織分離的菌絲萌發(fā)率大、污染率小、分離成功率高;松乳菇菌絲在酵母葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率快、長(zhǎng)勢(shì)好，在PDA中添加干松針浸出液有利于松乳菇菌絲的培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：松乳菇;菌絲培養(yǎng);組織分離法;培養(yǎng)基

松乳菇（Lactarius deliciosus），隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、蘑菇目（Agaricales）、紅菇科（Russulaceae）、乳菇屬（Lactarius），別名松樹(shù)菌、松菌、紫花菌、美味松乳菇，是一種外生菌根真菌，其味道鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，是兼具食藥用價(jià)值的珍貴食用菌，深受?chē)?guó)內(nèi)外市場(chǎng)歡迎[1-2]。因松乳菇菌絲生長(zhǎng)緩慢，需與宿主植物建立共生關(guān)系，且在適宜的生態(tài)條件下才能產(chǎn)生子實(shí)體，所以難以進(jìn)行人工栽培[3]。目前，在新西蘭等國(guó)進(jìn)行了松乳菇仿野生人工栽培并獲得成功[4-5]，但國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，且松乳菇菌種分離培養(yǎng)難度大，不同的分離培養(yǎng)條件對(duì)松乳菇菌絲生長(zhǎng)有著較大的影響[6-8]。

本研究通過(guò)考察不同部位組織分離法和不同培養(yǎng)基對(duì)松乳菇菌絲培養(yǎng)的影響，為成功獲得松乳菇菌種及后續(xù)開(kāi)展松乳菇仿人工栽培提供依據(jù)。

1 ? 材料與方法

松乳菇為采集自貴陽(yáng)市高坡市場(chǎng)的野生松乳菇，子實(shí)體完整，無(wú)損傷。

1.1 ? 試劑

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O為分析純（AR）;酵母粉為生化試劑（BR）;馬鈴薯、鮮松針、干松針等為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 ? 培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH值自然;

（2）酵母葡萄糖培養(yǎng)基（JM）：酵母浸出粉5 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O為0.5 g，KH2PO4為1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值自然;

（3）鮮松針PDA培養(yǎng)基（SXZ）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，鮮松針浸出液（鮮松針200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然;

（4）干松針PDA培養(yǎng)基（SXG）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，干松針浸出液（干松針200 g+水1 000 mL煮沸），pH值自然。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? 不同部位組織分離

挑選2個(gè)新鮮的野生松乳菇子實(shí)體，用軟刷去除表面雜質(zhì)，再用75%酒精擦拭表面1～2次。在超凈工作臺(tái)上，用手將消毒處理過(guò)的松乳菇子實(shí)體從中間一分為二掰開(kāi)，盡量不要觸碰到子實(shí)體內(nèi)部，然后用經(jīng)過(guò)滅菌處理的解剖刀分別從菌柄、菌柄與菌肉交界處、菌肉3個(gè)部位，切取2～3 mm大小的組織塊放入PDA平板培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)，記錄不同部位組織分離的菌絲萌發(fā)、污染等情況。

萌發(fā)率=萌發(fā)數(shù)量/分離總數(shù)×100%;污染率=污染數(shù)量/分離總數(shù)×100%;成功率=成功數(shù)量/分離總數(shù)×100%。

1.3.2 ? 菌種保存與活化

待菌絲萌發(fā)后，選取無(wú)污染、長(zhǎng)勢(shì)好的菌絲再次轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲接近長(zhǎng)滿平板表面時(shí)轉(zhuǎn)入PDA斜面試管中，于4 ℃溫度條件的冰箱內(nèi)保存。將保存的松乳菇菌株接種到PDA平板培養(yǎng)基，活化10～20 d備用。

1.3.3 ? 不同培養(yǎng)基接種

分別將酵母葡萄糖培養(yǎng)基、鮮松針PDA培養(yǎng)基和干松針PDA培養(yǎng)基制作成平板（D=9 cm）培養(yǎng)基，挑取1塊活化的松乳菇菌塊（0.3 cm2）接種到培養(yǎng)基中央，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)35 d，觀察并測(cè)定松乳菇菌落形態(tài)、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、顏色、生長(zhǎng)速率等。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 不同部位組織分離法對(duì)松乳菇分離的影響

采用組織分離法對(duì)松乳菇的不同部位進(jìn)行分離試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可見(jiàn)，松乳菇子實(shí)體不同部位組織分離的污染率由大至小分別為：菌柄>菌肉>菌柄與菌肉交界處;從萌發(fā)情況來(lái)看，菌柄與菌肉交界處萌發(fā)數(shù)量較多，自菌肉和菌柄部位分離的部位萌發(fā)率較低;分離成功率最高的為菌柄與菌肉交界處，成功率最低的為菌柄處。

2.2 ? 不同培養(yǎng)基對(duì)松乳菇菌絲培養(yǎng)的影響

2.2.1 ? 菌絲和菌落特征

由圖1可見(jiàn)，在不同的培養(yǎng)基上松乳菇的菌絲和菌落形態(tài)有較大差異。在SXG和PDA培養(yǎng)基上，菌落呈棕黃色，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，顏色不斷加深，部分有縱向鉤紋形成，菌絲粗壯，呈針尖狀，平匍或稍向空中延生生長(zhǎng);在SXZ培養(yǎng)基上，菌塊周?chē)邪瞪爻恋淼臅炄?，菌落棕黃偏橘色，菌絲較細(xì)短，呈茸毛狀，部分產(chǎn)生溶解性菌液;在JM培養(yǎng)基上，菌落初期白色，后呈淡黃色，菌絲細(xì)密，匍匐貼壁生長(zhǎng)。

2.2.2 ? 菌絲生長(zhǎng)速度

由表2可以得知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，4種培養(yǎng)基上松乳菇菌絲開(kāi)始萌發(fā)、生長(zhǎng)，在20～25 d前菌絲生長(zhǎng)較快、菌落直徑不斷增大;25～30 d后菌絲生長(zhǎng)變緩慢、菌落直徑增幅變化不大。其中，菌絲在JM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑最大，在第35天時(shí)菌落直徑達(dá)到最大值31.90 mm;其次是在SXG和PDA培養(yǎng)基上，第30天時(shí)菌落直徑分別達(dá)到8.41 mm和6.53 mm;而在SXZ培養(yǎng)基上，第25天時(shí)菌落直徑只有4.96 mm，之后菌絲停止生長(zhǎng)。

3 ? 討論

通過(guò)比較不同部位組織分離法和不同培養(yǎng)基對(duì)松乳菇分離及菌絲培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，在進(jìn)行松乳菇組織分離時(shí)，選取松乳菇菌柄和菌肉交界處的組織塊更有利于菌種分離成功;選擇以酵母浸出粉作為氮源的JM培養(yǎng)基有利于松乳菇菌絲快速生長(zhǎng);在PDA中添加干松針浸出液有利于菌絲形成;但在PDA中添加鮮松針浸出液則不利于菌絲生長(zhǎng)，甚至?xí)a(chǎn)生抑制作用。

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