喻曉路 傅慧

摘要：目的 ?探討腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）在缺糖缺氧復(fù)灌條件下對mPFC腦區(qū)突觸前膜蛋白Synapsin-1的保護作用。方法 ?將18只小鼠隨機分為正常組、缺糖缺氧復(fù)灌組、缺糖缺氧復(fù)灌給藥組，每組6只。正常組mPFC腦區(qū)低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，缺糖缺氧復(fù)灌組（OGD/R）mPFC腦區(qū)EBSS培養(yǎng)基培養(yǎng)15 min后復(fù)灌1 h，缺糖缺氧復(fù)灌給藥組（OGD/R+BDNF）mPFC腦區(qū)EBSS培養(yǎng)基中加入BDNF培養(yǎng)15 min后復(fù)灌1 h，采用免疫印跡分析和RT-qPCR檢測分析突觸前膜蛋白Synapsin-1的表達量和mRNA表達量。結(jié)果 ?缺糖缺氧復(fù)灌組Synapsin-1蛋白和mRNA表達量低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;缺糖缺氧復(fù)灌給藥組Synapsin-1蛋白表達量高于缺糖缺氧復(fù)灌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;缺糖缺氧復(fù)灌給藥組Synapsin-1蛋白和mRNA表達量與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 ?缺糖缺氧對mPFC腦區(qū)神經(jīng)元突觸有損傷作用，BDNF對神經(jīng)元突觸起到保護作用。

關(guān)鍵詞：腦源性神經(jīng)生長因子;mPFC;缺糖缺氧;突觸前膜蛋白

中圖分類號：R614 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.17.018

文章編號：1006-1959（2020）17-0063-04

Abstract：Objective ?To investigate the protective effect of brain-derived nerve growth factor （BDNF） on the presynaptic membrane protein Synapsin-1 in mPFC brain under the condition of hypoglycemia and hypoxia reperfusion.Methods ?18 mice were randomly divided into normal group， hypoglycemia and hypoxia reperfusion group， hypoglycemia and hypoxia reperfusion administration group， 6 mice in each group. Normal group mPFC brain area was cultured in low-sugar DMEM medium， hypoglycemia hypoxia reperfusion group （OGD/R） mPFC brain area EBSS medium was cultured for 15 min and then reperfused for 1 h， hypoglycemia hypoxia reperfusion administration group （OGD/R+BDNF） mPFC brain area EBSS medium was cultured with BDNF for 15 min and reperfused for 1 h.Western blot analysis and RT-qPCR were used to analyze the expression and mRNA expression of the presynaptic membrane protein Synapsin-1.Results ?The expression of Synapsin-1 protein and mRNA in the hypoglycemia and hypoxia reperfusion group was lower than that of the normal group，the difference was statistically significant （P<0.05）;Synapsin-1 protein expression in the hypoglycemia and hypoxia reperfusion administration group was higher than that of the hypoglycemia hypoxia reperfusion group， the difference was statistically significant （P<0.05）; Synapsin-1 protein and Compared with the normal group， the mRNA expression level was not statistically different （P>0.05）.Conclusion ?Glucose and hypoxia could damage neuronal synapses in the mPFC brain region， and BDNF could protect neuronal synapses.

Key words：Brain-derived nerve growth factor;mPFC;Hypoglycemia and hypoxia;Presynaptic membrane protein

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 ?采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0進行處理，計量資料采用（x±s）表示，采用單因素方差分析，one-way ANOVE進行組間比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組小鼠mPFC腦區(qū)病理形態(tài) ?鏡檢結(jié)果顯示，三組腦片中細胞核形態(tài)清晰、完整，提示模型制作成功，短時間的缺塘缺氧沒有造成大面積的組織壞死和細胞凋亡，完全符合后續(xù)實驗要求，見圖1。

2.2三組小鼠mPFC腦區(qū)Synapsin-1蛋白表達比較 ?WB檢測結(jié)果顯示，正常組Synapsin-1蛋白的相對表達量為（1.0573436±0.171485464），缺糖缺氧復(fù)灌組Synapsin-1蛋白的相對表達量為（0.702825767±0.03653467），缺糖缺氧復(fù)灌給藥組Synapsin-1蛋白的相對表達量為（0.845764±0.073608716）;缺糖缺氧復(fù)灌組Synapsin-1蛋白的表達量低于正常組、缺糖缺氧復(fù)灌給藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;缺糖缺氧復(fù)灌給藥組與正常組Synapsin-1蛋白表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖2。

2.3三組小鼠mPFC腦區(qū)Synapsin-1 mRNA相對表達量比較 ?正常組Synapsin-1 mRNA的相對表達量為（1.00000±1.00000），缺糖缺氧復(fù)灌組Synapsin-1 mRNA的相對表達量為（0.4126427±0.299804），缺糖缺氧復(fù)灌給藥組Synapsin-1 mRNA的相對表達量為（0.604788±0.271342）。正常組Synapsin-1 mRNA的相對表達量高于缺糖缺氧復(fù)灌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;缺糖缺氧復(fù)灌給藥組Synapsin-1 mRNA相對表達量與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖3。

3討論

突觸前膜蛋白Synapsin-1是一種進化中高度保守的蛋白質(zhì)，定位于突觸囊泡膜上，是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的特征性膜蛋白，其數(shù)量和分布密度可以間接反映突觸的密度[11，12]。腦源性神經(jīng)生長因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達，不僅能促進神經(jīng)元的發(fā)育和分化、細胞存活及突觸可塑性，同時具有抗凋亡、抗氧化、抑制自噬等神經(jīng)保護作用，目前已有的研究表明BDNF與多種退行性疾病有關(guān)，可以通過多種途徑保護受損的腦組織[13，14]。腦部缺糖缺氧是腦缺血病患的主要癥狀，可以導(dǎo)致患者殘疾或者死亡[15，16]。眾多研究表明，腦組織缺糖缺氧會誘發(fā)一系列的病理變化，甚至短暫性的缺糖缺氧也會對神經(jīng)元造成一定的損傷，以致患者行為改變。目前，研究認為BDNF在神經(jīng)系統(tǒng)中起保護作用，但對于其在mPFC腦區(qū)缺糖缺氧的治療效果研究較少[17，18]。本次實驗通過模擬短暫性腦缺血疾病，旨在觀察外源性BDNF的治療效果。

本研究結(jié)果顯示，15 min的缺糖缺氧腦片沒有對神經(jīng)元的形態(tài)和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞性的影響，說明短暫性腦缺血不會造成大面積的腦組織壞死。在對突觸前膜蛋白表達量和mRNA的檢測結(jié)果顯示，缺糖缺氧復(fù)灌組與正常組相比，Synapsin-1蛋白和mRNA的表達量降低;缺糖缺氧復(fù)灌給藥組與缺糖缺氧復(fù)灌組相比，Synapsin-1的蛋白表達量升高;與正常組相比，Synapsin-1的蛋白和mRNA表達量基本一致。有報道顯示，Synapsin-1與腦缺血引起的神經(jīng)元損傷和腦梗塞有關(guān)，并通過Bcl-XL來影響其病理改變[19]。缺糖缺氧對腦組織的損傷主要表現(xiàn)在突觸形成上，在與運動、學(xué)習(xí)記憶等功能密切相關(guān)的mPFC腦區(qū)，可反映突觸形成的突觸前膜蛋白Synapsin-1的表達量存在明顯降低，說明缺糖缺氧條件下突觸形成降低，從而影響患者行為學(xué)的改變。通過本次研究可以發(fā)下，BDNF可在短暫性缺糖缺氧mPFC腦區(qū)中上調(diào)突觸前膜蛋白和mRNA的表達，促進神經(jīng)損傷后突觸形成的恢復(fù)，其原因可能是BDNF作為一種重要的腦源性神經(jīng)生長因子對于腦內(nèi)神經(jīng)元具有保護和營養(yǎng)作用，其不僅參與神經(jīng)元突觸的形成，還可影響突觸形成后的功能[20]。

綜上所述，缺糖缺氧對mPFC腦區(qū)神經(jīng)元突觸有損傷作用，BDNF對神經(jīng)元突觸起到保護作用。

參考文獻：

[1]任藝，崔偉華，王珊珊，等.不同濃度嗎啡對新生小鼠皮層神經(jīng)元活力和突觸可塑性的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2018，38（10）：1190-1193.

[2]Patzke C，Brockmann MM，Dai J，et al.Neuromodulator Signaling Bidirectionally Controls Vesicle Numbers in Human Synapses[J].Cell，2019，179（2）：498-513.e22.

[3]Song M，Martinowich K，Lee FS.BDNF at the synapse：why location matters[J].Molecular Psychiatry，2017，22（10）：1370-1375.

[4]BjRkholm C，Monteggia LM.BDNF-a key transducer of antidepressant effects[J].Neuropharmacology，2016（102）：72-79.

[5]呂秀芳，胡寶英，鞏秀，等.內(nèi)側(cè)前額葉皮層神經(jīng)元可塑性改變在嗎啡獎賞記憶形成中的作用[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2014，23（12）：1061-1064.

[6]Cho JH，Deisseroth K，Bolshakov V.Synaptic Encoding of Fear Extinction in mPFC-amygdala Circuits[J].Neuron，2013，80（6）：1491.

[7]Liu X，Tian F，Wang S，et al.Astrocyte Autophagy Flux Protects Neurons Against Oxygen-Glucose Deprivation and Ischemic/Reperfusion Injury[J].Rejuvenation Res，2017（2017）：1999.

[8]Ryou MG，Mallet RT.An In Vitro Oxygen-Glucose Deprivation Model for Studying Ischemia-Reperfusion Injury of Neuronal Cells[J].Methods Mol Biol，2018（1717）：229-235.

[9]Fu-Sheng Chou，Pei-Shan Wang.Neuronal Precursor Migration in Ex Vivo Brain Slice Culture[J].Cell Migration，2018（1749）：135-143.

[10]Christian，Humpel.Organotypic Brain Slice Cultures[J].Current Protocols in Immunology，2018.

[11]Maesako M，Zoltowska KM，Berezovska O.Synapsin 1 promotes Aβ generation via BACE1 modulation[J].PLoS One，2019，14（12）：e0226368.

[12]Navya A，Bianca F，Hari P，et al.Neonatal anesthesia impairs synapsin 1 and synaptotagmin 1，two key regulators of synaptic vesicle docking and fusion[J].Neuroreport，2019（2019）：544-549.

[13]Zaletel I，F(xiàn)ilipovi D，PuKa N.Hippocampal BDNF in physiological conditions and social isolation[J].Reviews in the Neuroences，2017，28（6）：675-692.

[14]Walsh JJ，Tschakovsky ME.Exercise and circulating BDNF：Mechanisms of release and implications for the design of exercise interventions[J].Applied Physiology，Nutrition，and Metabolism，2018，43（11）：1095-1104.

[15]Tasca CI，Dal-Cim T，Cimarosti H.In Vitro Oxygen-Glucose Deprivation to Study Ischemic Cell Death[J].Methods in Molecular Biology，2015（1254）：197-210.

[16]Povysheva N，Nigam A，Brisbin AK，et al.Oxygen-Glucose Deprivation Differentially Affects Neocortical Pyramidal Neurons and Parvalbumin-Positive Interneurons[J].Neuroscience，2019（412）：72-82.

[17]Cheriyan J，Sheets PL.Altered Excitability and Local Connectivity of mPFC-PAG Neurons in a Mouse Model of Neuropathic Pain[J].J Neurosci，2018，38（20）：4829-4839.

[18]Lieberman MD，Straccia MA，Meyer ML，et al.Social，Self，（Situational），and Affective Processes in Medial Prefrontal Cortex（MPFC）：Causal，Multivariate，and Reverse Inference Evidence[J].Neuroscience&Biobehavioral Reviews，2019.

[19]Kilic E，Hermann DM，Kügler S，et al.Adenovirus-mediated Bcl-X（L）expression using a neuron-specific synapsin-1 promoter protects against disseminated neuronal injury and brain infarction following focal cerebral ischemia in mice[J].neurobiology of disease，2002，11（2）：275-284.

[20]Leal G，Bramham CR，Duarte CB.BDNF and Hippocampal Synaptic Plasticity[J].Vitamins and Hormones，2017（104）：153-195.

收稿日期：2020-06-04;修回日期：2020-06-14

編輯/成森