李蘭麗，姜麗麗，夏楊柳，劉勇

（大連理工大學生命科學與藥學學院，遼寧 盤錦 124221）

撲熱息痛（paracetamol，APAP）又稱對乙酰氨基酚、醋氨酚，是世界上應用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床上常與其他藥物聯(lián)合使用。過量服用APAP可導致肝毒性和急性肝功能衰竭［1］。APAP在人體內(nèi)主要通過肝臟中多種尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs）介導的葡萄糖醛酸化反應清除，其中最主要的是尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶1A9 （UDPglucuronosyltransferases1A9，UGT1A9）［2-3］。UGTs是人體內(nèi)一類重要的Ⅱ相代謝酶，參與了許多內(nèi)源性物質(zhì)（如膽紅素）和外源性化學物（如藥物）的代謝清除［4-5］。研究［6-8］表明，當與APAP同時服用的藥物對UGTs活性具有抑制作用時，APAP的不良反應率可能會增加，甚至引發(fā)嚴重的肝毒性。

抗病毒藥物達塞布韋，又名ABT-333，是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的新型非核苷抑制劑，通過抑制NS5B的RNA聚合酶抑制HCV復制［9］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，達塞布韋對幾種UGTs有抑制作用，且HCV治療周期較長［11］，因此，達塞布韋在臨床上與其他藥物同時服用時，有可能通過其對某些UGTs的抑制導致藥物相互作用［12］。

本研究擬利用酶動力學和藥物相互作用預測模型，定量評價達塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化的抑制作用，并預測由此引發(fā)藥物相互作用的危險度，以期為達塞布韋的臨床安全應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

p-乙酰氨基苯-β-D-葡萄糖酸鈉鹽（p-acetamidophenyl β-D-glucuronide sodium salt，APAPG），尿苷-5’-二磷酸葡糖醛酸三鈉鹽（uridine 5’-diphosphoglucuronic acid trisodium salt，UDPGA）購自美國Sigma-Aldrich公司。人肝微粒體（human liver microsomes，HLMs）購自上海瑞德肝臟疾病研究有限公司。人重組UGT1A9購自美國康寧公司。APAP、3’-羥基乙酰苯胺購自中國阿拉丁公司。達塞布韋購自美國Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化動力學研究:選用混合HLMs反應體系孵育系統(tǒng)［12］，在含有HLMs（0.5 mg/mL）、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 （pH7.4）、丙甲菌素（2.5 mg/mL）、MgCl2（100 mmol/L）、底物APAP（終濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0 mmol/L）和UDPGA （50 mmol/L）的200 μL總體積典型孵育混合體系中，進行酶促反應，所有實驗設置2個平行組。上述條件加入Tris-HCl、HLMs、丙甲菌素后輕輕渦旋5 s，冰浴15 min后，再依次向EP管內(nèi)加入MgCl2、APAP后渦旋5 s，在37 ℃下預溫孵育5 min后，將啟動反應的輔助因子UDPGA加入到該體系中啟動反應。在37 ℃下反應30 min后，向該體系加入100 μL冰乙腈（含內(nèi)標物3-乙酰氨基苯酚，1 mmol/L）終止反應，并渦旋混勻后放入冰中。4 ℃、20 000g離心15 min，取上清液再離心1次后，取50 μL上清液轉移至進樣瓶中。將上清液（10 μL）注入高效液相色譜儀HPLC （Waters 2695，美國沃特世公司）中進行分析。分離柱為Tnature C18［4.6 mm ×250 mm，5 μm，中國華譜科儀（北京）科技有限公司與美國沃特世公司聯(lián)合出品］。UV檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min。流動相A和B分別含有1.19 %冰醋酸和甲醇。比例為84%A液和16%B液，進樣20 min。通過使用標準曲線定量APAP代謝物APAPG。

1.2.2 達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用研究:將10 mmol/L APAP與達塞布韋（0～200 μmol/L）分別在0.5 mg/mL的HLMs或重組UGT1A9反應體系中孵育反應。達塞布韋和APAP溶于DMSO中（終濃度為1%），加入達塞布韋的催化APAP葡萄糖醛酸化活性/空白的活性的百分比值作為Y軸，lg （達塞布韋濃度）的值作為X軸，從而擬合出IC50值來評價藥物的抑制作用。

1.2.3 達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化抑制動力學研究:根據(jù)前期實驗結果和文獻［6］作為參考，設置底物濃度覆蓋其Km值參考范圍。另根據(jù)前面的抑制作用實驗得到的IC50為參考，設置抑制作用藥物達塞布韋濃度覆蓋IC50值范圍。將不同濃度的APAP（5、10、15、或20 mmol/L）和達塞布韋（1、2、4、或8 μmol/L）孵育于HLMs（0.5 mg/mL）或重組UGT1A9（蛋白質(zhì)終濃度為0.5 mg/mL）。分別利用競爭性抑制公式（1）{v=（VmaxS）/ （Km（1+［I］/Ki） +S） }、非競爭性抑制公式（2）{v=（VmaxS）/ （Km+S） （1+［I］/Ki） }、反競爭性抑制公式（3）{v=（VmaxS）/ （Km+（1+［I］/Ki） S） }和混合性抑制公式（4）{v=（VmaxS）/ （（Km（1+［I］/Ki） +S （1+［I］/αKi） }進行數(shù)據(jù)擬合，判斷抑制類型并求得抑制常數(shù)Ki。上述公式中，v和Vmax分別表示反應速度和最大反應速度，Km是反應速度為最大反應速度的一半時的底物濃度，Ki是表觀抑制常數(shù)，表示酶與抑制劑的親和力，S是底物濃度，［I］是抑制劑濃度。分別利用Lineweaver-Burk作圖法和Dixon作圖法來直觀表現(xiàn)抑制類型及Ki。

1.2.4 計算曲線下面積（area under curve，AUC）比率以定量預測藥物相互作用風險度:因達塞布韋的抑制而導致的藥物相互作用危險度的預測根據(jù)存在和不存在抑制劑達塞布韋的情況下APAP的AUC的比率{AUCi/AUC=1/ （fm/ （1+［I］/Ki）+（1-fm） }［13］來進行預測。其中，Ki是從體外實驗獲得的抑制劑常數(shù)；fm是被抑制酶代謝的比例（fm=0.55）［14］，APAP藥物主要由UGTs代謝。［I］是酶活性位點上的抑制劑濃度。既往研究［9］表明，在該計算模型中使用［I］in作為參數(shù)來評估藥物相互作用較為準確。［I］in是最大肝輸入藥物濃度。有研究［13］表明，用［I］in參數(shù)代替［I］參數(shù)評估藥物相互作用更加準確。計算公式為［I］in=［I］av+kaFaD/Qh。其中，ka是達塞布韋吸收速率常數(shù)，其值為0.5 （1/h）；Fa是從腸道進入血中的吸收比例，其值為0.7；D代表給藥劑量（250 mg/次，2次/d）［15］；Qh是肝的血液流速（1 610 mL/min［13］）；達塞布韋的ka、Fa參數(shù)均能從文獻［10］中獲取。［I］av是反復口服達塞布韋后系統(tǒng)血漿濃度的平均值。計算公式為［I］av=（D/τ）/ （CL/F） 。其中，τ代表給藥間隔，其值為12 h；CL/F是藥物的表觀清除率，其值為1 150 L/d［12］。

2 結果

2.1 HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化動力學

結果顯示，HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化反應符合米氏方程，米氏常數(shù)Km和最大反應速度Vmax分別為（10.84±2.07） mmol/L和 （26.20±1.85） pmol·min-1·mg-1protein。

2.2 HLMs中達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用

圖1 人肝微粒體中達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用Fig.1 The inhibited effect of dasabuviron on paracetamol glucuronidation in pooled HLMs

如圖1A所示，隨著達塞布韋濃度的增加，溫孵體系中APAP葡萄糖醛酸化產(chǎn)物量明顯減少，表明達塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化反應具有較強的抑制作用，其IC50值為（3.94±1.29） μmol/L。進一步對抑制動力學實驗數(shù)據(jù)進行非線性回歸分析及Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖。Lineweaver-Burk作圖得到圖1B，隨著不同抑制物（達塞布韋）濃度的增加，直線的傾斜率增加且交于X軸同一點，由此可知達塞布韋是通過非競爭可逆性抑制機制作用于APTP葡萄糖醛酸化過程的。根據(jù)Dixon作圖法得到圖1C，可擬合得到其表觀抑制常數(shù)Ki值為（5.50±0.46） μmol/L。

2.3 UGT1A9中達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制作用

如圖2A所示，在單酶UGT1A9體系中，達塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化具有較強的抑制作用，其IC50值為（5.24±1.26） μmol/L。非線性回歸分析及Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖（圖2B、2C）表明，達塞布韋通過非競爭性的可逆性抑制機制作用于APAP葡萄糖醛酸化過程，Ki值為（4.92±0.46） μmol/L。與HMLs體系中得到的動力學參數(shù)相似，表明達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化反應的抑制主要通過抑制UGT1A9完成。

圖2 UGT1A9中達塞布韋對APTP葡萄糖醛酸化的抑制作用Fig.2 The inhibited effect of dasabuvir on paracetamol glucuronidation in UGT1A9

2.4 AUC比率

根據(jù)查到的參數(shù)，結合公式可計算得到反復口服達塞布韋后系統(tǒng)血漿濃度的平均值，即［I］av的值為0.88 μmol/L，并得到最大肝輸入藥物濃度，即［I］in為2.97 μmol/L。最后，將體外HLMs中達塞布韋對APAP葡萄糖醛酸化的抑制常數(shù)（Ki=5.50 μmol/L）帶入到公式中，進而得出APAP的AUC的比率（AUCi/AUC）為1.27，即達塞布韋與APAP同時服用時APAP的AUC較單獨服用APAP時將增加27%，提示二者聯(lián)合用藥時發(fā)生藥物相互作用的可能性很大，應當引起重視。

3 討論

達塞布韋對UGTs有抑制作用［10］，而APAP又主要由UGTs催化代謝。APAP的毒性與APAP葡萄糖醛酸化抑制程度相關［6］，即UGTs活性受到抑制的情況下，APAP葡萄醛酸化物量減少，其母藥在體內(nèi)暴露量增加，毒性增加，這也是APAP導致肝毒性的主要原因之一。因此，當達塞布韋與APAP聯(lián)合用藥時，有可能導致參與APAP代謝的UGTs受到抑制，進而引發(fā)不良反應。由于肝內(nèi)的UGTs有一定的底物特異性，因此，本研究中首先探討了達塞布韋是否對APAP的葡萄糖醛酸化有影響。HLMs中APAP的葡萄糖醛酸化動力學研究的實驗數(shù)據(jù)表明，本研究測定的Km值和文獻［6］報道相近，說明本實驗的反應體系中HLMs中的酶活性較好，可進行后續(xù)實驗。

本研究發(fā)現(xiàn)，在HLMs中，達塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化具有較強的非競爭性抑制作用。HLMs中有很多種UGTs亞型［16］，在APAP正常發(fā)揮藥效的血藥濃度條件下，UGT1A9對APAP的葡萄糖醛酸化發(fā)揮著重要的催化作用［6］。因此，本研究進一步在UGT1A9單酶體系中進行了酶抑制動力研究。結果表明，UGT1A9單酶體系中和HLMs中的結果相似，均為非競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki也相近，說明HLMs中達塞布韋對APAP的葡萄糖醛酸化的抑制作用主要通過UGT1A9完成。

fm是指底物被參與其代謝的酶代謝的比例（fm=0.55）［14］，參數(shù)fm是DDI風險評估的關鍵參數(shù)［17］，在很多研究DDI的文獻［18-19］中都會引用到該參數(shù)。值得注意的是，本研究中藥物相互作用預測計算結果僅僅基于達塞布韋對肝中的UGTs的抑制作用，然而，UGT1A9還存在于肝外組織，如腸道、腎臟中［20］?？诜幬镌谶_到系統(tǒng)循環(huán)前需穿過胃腸道壁，在吸收過程中由于腸和肝而損失藥物的過程稱為首過效應。因此，若考慮到達塞布韋對肝外組織UGTs的抑制作用，即對首過效應的抑制可能引起血藥濃度增高，其AUC比率會更高。另外，用于計算血藥濃度的藥代動力學參數(shù)是采用人群的平均值參數(shù)，但個體間的變異性很高，某些個體中達塞布韋血藥濃度更高［21］。此外，APAP的最大血藥濃度（Cmax）可以因空腹攝入而增加1.72倍［22］，且有研究［23］表明體外數(shù)據(jù)傾向于低估體內(nèi)藥物葡萄糖醛酸化的抑制作用。綜上所述，臨床上由于達塞布韋對UGTs的抑制作用，APAP的AUC增加的結果應當比計算預測的更多，特別是對于一些達塞布韋血液濃度較高的人。根據(jù)公式（1）預測得到AUC將是原來的1.27倍，而美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定預測的AUC比率在0.8～1.25就應當進行體內(nèi)實驗的初篩標準。因此，達塞布韋與APAP聯(lián)用時，在體內(nèi)可能會使APAP的AUC增加而產(chǎn)生肝毒性，應引起臨床醫(yī)生的警惕。

盡管已有研究［24-25］預測體內(nèi)抑制藥物相互作用的危險度，但從體外數(shù)據(jù)外推到體內(nèi)藥物相互作用的結果仍需謹慎對待。體內(nèi)的藥物代謝受各種因素影響，如與體內(nèi)大分子蛋白的結合、藥物分子一系列的轉運蛋白和代謝酶的情況都可影響藥物濃度的估算。另外，不同于已有大量報道的細胞色素P （cytochrome，CYP） 450酶介導的藥物相互作用，現(xiàn)在對由于UGTs抑制或誘導引發(fā)的藥物相互作用的研究［13］較少，不便于通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析推導出更適合UGTs介導的藥物相互作用模型。因此，為了進一步確定達塞布韋與APAP聯(lián)用是否會引起APAP肝毒性的發(fā)生，仍需進一步的體內(nèi)研究。而FDA只考慮到CYP和轉運體介導的藥物相互作用，忽略了UGTs介導的藥物相互作用。本研究結果作為一個初篩，為臨床醫(yī)生的安全合理用藥提供理論建議。在臨床中，當達塞布韋與APAP聯(lián)用時，需留意監(jiān)測服藥者的APAP的血藥濃度以免發(fā)生藥物的不良反應。