趙耀東，胡進(jìn)平，陶博強(qiáng)，，胡浩博，劉映坤，王東旭，陳 健*

1.吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理處，吉林長春 130000；2.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林長春 130021

稀毛小鼠作為珍貴的動(dòng)物模型，在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有重要的作用，尤其是在皮膚病模型、腫瘤模型方面。因?yàn)樾∈蟊憩F(xiàn)為無毛或被毛稀疏，所以在進(jìn)行很多疾病研究之前不需要脫毛，而且在研究過程中表型更容易觀察到。裸小鼠是一種常見的被毛突變小鼠，常用于神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等疾病的模型構(gòu)建。除了裸小鼠外，最常用的無毛小鼠是SKH1。SKH1 小鼠的毛發(fā)缺失和色素沉著導(dǎo)致它們被廣泛用于光生物學(xué)和光致癌研究。然而，這種小鼠模型的一個(gè)主要缺點(diǎn)為它們是異種繁殖的。NIH 小鼠，即NIH Swiss mouse，是美國國立衛(wèi)生研究所培育的一種遠(yuǎn)交群小鼠。新型NIH 稀毛小鼠是2007 年在正常的NIH小鼠封閉群的繁育過程中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠，表現(xiàn)為毛發(fā)稀疏、無胡須，之后就以近交系的繁育方式將這一自發(fā)突變小鼠保留了下來。自發(fā)基因突變小鼠模型缺少了人為因素的干擾，在疾病發(fā)生的過程與相應(yīng)人類疾病的發(fā)生更加貼合。由于對NIH 稀毛小鼠的遺傳規(guī)律、免疫能力等生物學(xué)特性尚不清楚，為了便于后續(xù)研究觀察，因此需要對新型NIH稀毛小鼠的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用NIH 稀毛小鼠保種繁育以及飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK（吉）2016-0001），SPF 級NIH 小鼠購買自長春生物制品所有限公司（SCXK（吉）2017-0005）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

氯仿、無水乙醇、異丙醇（北京化工廠）；移液吸頭、EDTA 抗凝管和離心管購置NEST 公司。

高壓滅菌器購自廈門致微；電子天平購自Mettler Toledo；多功能酶標(biāo)儀購自Bio-Tek；恒溫培養(yǎng)箱和恒溫振蕩器購自上海一恒；血細(xì)胞分析儀購自IDEXX；獨(dú)立送風(fēng)籠具和超凈工作臺購自蘇州馮氏；干式生化儀購自FUJI DRI-CHEM NX500iVC，高速冷凍離心機(jī)購自Thermo；光學(xué)顯微鏡購自Nikon；Morris 水迷宮分析軟件選用Panlab，SMART 3.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

本文葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)所用葡萄糖劑量為1 g/kg（一般用量為1.5 ～2 g/kg），配制10%葡萄糖的生理鹽水溶液，小鼠從前一天下午17:00 至次日上午9:00 共計(jì)禁食16 h，飲水正常。注射前稱重標(biāo)號，測定血糖，按體重腹腔注射0.01 mL/g 劑量的葡萄糖，每2 只之間間隔1 min，注射后在15、30、60、90 min各測一次血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后正常飼養(yǎng)。根據(jù)小鼠的性別和年齡決定胰島素用量，以注射30 min 后葡萄糖水平下降至之前的40%左右為宜。小鼠上午不禁水，禁食4 h。下午稱重標(biāo)號，測定血糖含量。生理鹽水稀釋胰島素，根據(jù)體重注射劑量1 U/kg，注射后在15、45、60、90、160 min 各測一次血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后正常飼養(yǎng)。

1.3.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前加水開機(jī)調(diào)試水迷宮，加入6 mL 藍(lán)墨水以加深背景色。水池所有功能運(yùn)行正常。加熱板預(yù)熱至50 ～60 ℃，使用白毛巾來為小鼠游泳后恢復(fù)狀態(tài)。

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)共計(jì)兩部分內(nèi)容。先進(jìn)行為期3 d 的定向航行實(shí)驗(yàn)。每只小鼠學(xué)習(xí)3 d 共計(jì)16 次，第1 天學(xué)習(xí)4 次，之后第2 ～3 天每天學(xué)習(xí)6 次。每兩次學(xué)習(xí)間隔至少30 min。水迷宮劃分為4 個(gè)象限，學(xué)習(xí)時(shí)小鼠面向壁，放入不同象限開始學(xué)習(xí)。在其中一個(gè)象限中央位置設(shè)置目標(biāo)平臺（目標(biāo)象限），實(shí)驗(yàn)結(jié)束標(biāo)準(zhǔn)為小鼠游至平臺并停留1 s 或達(dá)到60 s的實(shí)驗(yàn)時(shí)長。其中未到目標(biāo)平臺的小鼠引導(dǎo)到目標(biāo)平臺后使其停留10 s。每次實(shí)驗(yàn)后將小鼠放在加熱板。記錄小鼠游動(dòng)到平臺的時(shí)間和距離，其中游動(dòng)時(shí)間即為逃避潛伏期。

定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的24 h 內(nèi)完成空間探索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)撤走目標(biāo)平臺，之后在目標(biāo)象限的對側(cè)象限輕輕放入小鼠，計(jì)時(shí)60 s。實(shí)驗(yàn)記錄小鼠在目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間和游動(dòng)距離的比例，以及小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)，并對各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的性別及組間分析比較采用配對t 檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。其中p＜0.05 與p＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

在葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（GTT）中，NIH 稀毛小鼠（HL）空腹和靜息狀態(tài)下血糖值比正常NIH 小鼠低。并且NIH 稀毛小鼠腹腔注射葡萄糖鹽水溶液15 min 后，其血糖值與正常小鼠相比顯著降低，糖耐量增高（圖1 所示）。在胰島素耐量實(shí)驗(yàn)中，NIH 稀毛小鼠與正常小鼠的胰島功能均正常，無區(qū)別（圖2 所示）。

圖1 葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：縱軸是血糖（mmol/L），橫軸是時(shí)間(min)，其中***表示p＜0.001。

圖2 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 NIH 稀毛小鼠學(xué)習(xí)記憶能力

Morris 水迷宮的定向航行實(shí)驗(yàn)表明，雄性NIH稀毛小鼠在訓(xùn)練第3 天逃避潛伏期比正常雄性NIH小鼠顯著降低，同時(shí)雌性NIH 稀毛小鼠比正常雌性小鼠極顯著降低（圖3B）。第3 天學(xué)習(xí)時(shí)雌性NIH稀毛小鼠比正常NIH 小鼠的游動(dòng)距離顯著降低，這是因?yàn)橛涡袝r(shí)間縮短（圖3A）。空間探索實(shí)驗(yàn)表明，NIH 稀毛小鼠比正常NIH 小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)顯著增加（圖4B）。其中在目標(biāo)象限的游動(dòng)時(shí)間和游動(dòng)距離方面，雄性NIH 稀毛小鼠所占的比例高于正常NIH 小鼠，且差異顯著（圖4C，D）。

圖3 定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 空間探索實(shí)驗(yàn)

3 討論

迄今為止，一些無毛小鼠品系已被用于研究免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、皮膚發(fā)育及其他問題，其中一些最為常用的品系如SKH1 等。自發(fā)稀毛突變的小鼠是研究毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長的重要的動(dòng)物模型。皮膚作為人體的第一道免疫屏障，其功能與全身免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)密切相關(guān)。NIH 稀毛小鼠作為一種新型的自發(fā)突變的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，可以為挑選疾病動(dòng)物模型提供一種新的選擇。但是目前為止對NIH 稀毛小鼠的研究極少，其生物學(xué)特性還尚不確定，為此我們對NIH 稀毛小鼠的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。本課題從遺傳規(guī)律、保種方式、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等方面入手，對NIH 稀毛小鼠進(jìn)行了初步了解。

在這之前有研究表明，NIH 稀毛小鼠在P7 和P42 時(shí)，毛發(fā)稀疏，特征明顯。我們的研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，在P7，P42 時(shí)NIH 稀毛小鼠表型為無毛、無胡須，與NIH 正常小鼠差異顯著，并能輕易區(qū)分。無毛小鼠非常適合進(jìn)行傷口愈合研究，因?yàn)檎Ｐ∈笮枰撁赡茉斐啥蝿?chuàng)傷，并且毛發(fā)的再生會掩蓋傷口，導(dǎo)致傷口的愈合情況不容易直接觀察。糖尿病一個(gè)明顯特征就是傷口愈合緩慢。糖耐量實(shí)驗(yàn)是識別糖耐量受損的唯一方法，也是判斷糖尿病患者的重要方法。根據(jù)給藥途徑的不同，可以分為口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）和腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（IGTT）兩類。Andrikopoulos 曾研究了不同給藥途徑以及不同禁食時(shí)間對小鼠GTT 實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果表明GTT 可用來識別糖耐量受損和糖尿病。為了研究該NIH 稀毛小鼠血糖是否正常以及是否適用于建立糖尿病疾病模型，本研究進(jìn)行了葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，NIH 稀毛小鼠腹腔注射葡萄糖后15 min 血糖值顯著低于正常小鼠，糖耐量增高，但是胰島功能是正常的。這提示NIH 稀毛小鼠可能存在糖代謝異常，其糖代謝異常的機(jī)制尚不明確，需要將其作為糖尿病模型的時(shí)候值得注意。

生物發(fā)光成像(BLI)是一種監(jiān)測小鼠大腦基因表達(dá)時(shí)空動(dòng)態(tài)的強(qiáng)大技術(shù)。然而，在小鼠發(fā)育和日常檢查期間，脫毛后的黑毛、皮膚色素沉著和毛發(fā)再生干擾了BLI。先前有研究表明，在成人的大腦和皮膚中都可以檢測到Hr mRNA 的高表達(dá)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)對嚙齒類動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)測試，并且已被證明是一項(xiàng)與海馬突觸可塑性和NMDA 受體功能密切相關(guān)的可靠測試。Duan、Ebrahimpour還有Chen 等通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，研究了小鼠在水迷宮路線的長度和老鼠找到站臺所需的時(shí)間與小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)系。結(jié)果證明，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增多，小鼠表現(xiàn)出了一定的空間學(xué)習(xí)能力。為了確定NIH 稀毛突變是否會對腦組織以及神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生影響進(jìn)而影響其作為神經(jīng)認(rèn)知有關(guān)的動(dòng)物模型的價(jià)值，本研究進(jìn)行了Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)稀毛小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。研究結(jié)果顯示NIH 稀毛小鼠的學(xué)習(xí)能力較正常小鼠顯著增強(qiáng)，且NIH 稀毛小鼠記憶力的增強(qiáng)與性別無關(guān)，雄性和雌性的NIH稀毛小鼠均有所升高。然而Hr 基因突變是否與海馬神經(jīng)突觸有關(guān)以及影響小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

NIH 稀毛小鼠是一種新型的自發(fā)突變的小鼠。因?yàn)槠涿l(fā)稀疏、無胡須的表型而受到研究人員的關(guān)注。在本研究中，確定NIH 稀毛小鼠符合孟德爾遺傳定律中單基因控制的，且根據(jù)近交系的交配法則，獲得了性狀顯著且穩(wěn)定遺傳的種群。葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)證明了NIH 稀毛小鼠與NIH 正常小鼠相比，糖耐量增高，代表其糖代謝受損或存在內(nèi)分泌異常，但是胰島素敏感性沒有明顯改變。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)證明了NIH 稀毛小鼠擁有一定的學(xué)習(xí)記憶能力。通過本次研究，明確了NIH 稀毛小鼠的部分生物學(xué)特性，為其近一步運(yùn)用于生物發(fā)光成像、動(dòng)物皮膚病模型、腫瘤模型等提供了新的模型。