莊煥偉 白樹堂 符洪犢 曹賢君 梁麗明 陳知群 羊家慧 歐陽華 程弦 張亮

1中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院心胸外科（海口570208）；2中山大學附屬第七醫(yī)院胸外科（廣東深圳518107）

據2018年WHO 最新統(tǒng)計，肺癌在世界范圍內的發(fā)病率超過11%，在所有惡性腫瘤中位居第一［1］。根據組織學特征，肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non?small cell lung carcinoma，NSCLC），其中NSCLC 在肺癌發(fā)病人群中占80%以上［2-3］。目前，臨床上對于肺癌的治療主要以手術加化療為主，但預后差，尤其是化療對人體毒副作用較大，基因靶向治療被認為是更精確、安全的治療方式，其中RNA 干擾和microRNA 等新型靶向基因技術在惡性腫瘤的臨床治療中顯示出很好的應用前景。

小分子RNA（microRNA，miRNA）是真核生物細胞內發(fā)現的一類長約22 個核苷酸序列的內源性非編碼單鏈RNA，主要通過與目標基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結合，發(fā)揮刺激或抑制mRNA 翻譯的作用［4］。miR?199a 是一類在人類細胞中廣泛存在的基因家族，在多種腫瘤組織中異常表達，并能調控多個細胞信號通路參與腫瘤細胞生長增殖、凋亡、侵襲與轉移和耐藥等生物學過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關［5-6］。但其對NSCLC 細胞的生物學活性是否有調控作用鮮有報道。本研究探討miR?199a 對NSCLC 細胞增殖、凋亡、轉移和侵襲過程的影響及其可能存在的作用機制，為臨床上NSCLC 的基因治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器正常肺上皮細胞BEAS?2B和NSCLC 細胞A549均購自中科院上海細胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（Gibco，美國）；miR?199a?mimics、miR?199a?NC 及miR?199a?inhibito引物序列（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Lipo?fectamineTM2000（Invitrogen，美國）；Annexin V?FITC/PI 凋亡試劑盒購自南京Beyotime 公司；CCK?8 試劑盒、EdU 試劑盒購自杭州四季青公司；、鼠抗人Wnt3a、β?catenin、C?myc、Survivin、E?cadherin、Vi?mentin 單克隆抗體，羊抗兔二抗購自美國Invitro?gen 公司；Trizol 購自美國Invitrogen 公司。

1.2 RT?PCR 檢測正常肺上皮細胞BEAS?2B 和NSCLC 細胞A549 內miR?199a 的表達解凍、復蘇正常肺上皮細胞BEAS?2B 和NSCLC 細胞A549，重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，每2～3 d 傳代1 次，收集對數期細胞，Trizol 提取總RNA，異丙醇處理后收集RNA 沉淀，75%乙醇洗滌，離心，棄上清液，DEPC 水溶解RNA。根據逆轉錄試劑盒說明，以β?actin 為內參進行PCR 擴增，反應條件：95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，進行灰度掃描分析，比較目的基因與β?actin 條帶灰度之比。miR?199a 上游引物序列：5′?TAGGCTTAGCTAGGCTAGGT?3′，下游序列5′?TCGATTGCTAGGCTAGCC?CA?3′；β?actin 引物序列：5′?TAGCTTCGGCATTAG?CTAAC?3′，下游序列5′?TAGGCTTAGCTTAGGCTA?GC?3′。每個實驗結果獨立重復3 次。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染將凍存的NSCLC細胞A549解凍、復蘇，重懸，取對數期細胞進行轉染。將細胞轉移至6 孔板，調整密度為5×105個/孔，在不含雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，后根據LipofectamineTM2000 試劑盒說明書所示步驟，將miR?199a?mimics、miR?199a?NC 及miR?199a?inhibi?tor 序列分別轉染至A549 細胞內，根據轉染物不同，將細胞分為3 組，分別為mimics 組、NC 組及in?hibitor 組，轉染6 h 后，將各組細胞轉移至完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以供后續(xù)實驗使用。

1.4 CCK?8 法檢測各組細胞增殖將轉染后細胞轉移至96 孔板，每孔內加入含2×103個細胞的完全培養(yǎng)基，于轉染24、48、72 和96 h 后，向每個實驗組細胞培養(yǎng)孔內加入90 μL 的完全培養(yǎng)基和10 μL 的CCK?8 試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，用紫外分光光度計檢測490 nm 波長處的吸光度，以此代表細胞增殖活性。每個實驗結果獨立重復3 次。

1.5 Annexin V?FITC/PI 聯合流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞轉染48 h 后，用預冷PBS 洗滌2 次，將細胞重懸于緩沖溶液中，調整細胞濃度為1×106個/mL，根據凋亡試劑盒說明書中所示步驟，向100 μL 細胞緩沖液中加入5 μL Annexin V?FITC 和5 μL PI，避光孵育15 min 后，每管內加入400 μL 緩沖液，使用流式細胞儀檢測各轉染組細胞凋亡情況。每個實驗結果獨立重復3 次。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將轉染后的細胞培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液，用滅菌的移液槍頭垂直于6 孔板底部劃直線，PBS 沖掉脫落細胞，于顯微鏡拍攝并測量劃痕寬度，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h 后再次于顯微鏡下觀察并測量劃痕寬度，以24 h 與0 h 劃痕寬度之比代表細胞遷移能力，比值越大，代表細胞遷移能力越強，反之越弱。每組細胞設置5 個復孔進行。

1.7 Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲能力向24 孔Transwell 小室的上室中加入預配的Matrigel基質膠（50 μL/孔），細胞轉染48 h 后，取對數期細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為2×106個/mL，以100 μL 體積接種于Transwell 小室的上室，下室內加入含血清的培養(yǎng)基600 μL，將小室置于常規(guī)細胞培養(yǎng)箱孵育48 h，去除小室，洗膜、固定細胞，結晶紫染色，顯微鏡下計數。

1.8 雙熒光素酶報告實驗將對數期A549細胞以2×105/孔的密度接種于24 孔板，用LipofectamineTM2000 將熒光素酶報告載體（Wnt3a?3′?UTR?WT 或Wnt3a?3′UTR?MT）與miR?199a?mimics/inhibitor/NC共轉染細胞，以Renilla 熒光素酶質粒（100 ng/孔）為對照，與載體共轉染。轉染48 h后，用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（Promega）檢測熒光素酶活性。

1.9 Western blot檢測各組細胞Wnt3a、β?catenin、C?myc、Survivin、E?cadherin 和Vimentin 蛋白表達細胞轉染48 h 后，收集各組細胞，RIPA 裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品加入SDS?PAGE 凝膠加樣孔進行電泳，使蛋白轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，TBST 溫和洗膜3 min 后加入相對應的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌10 min×3 次，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST 洗滌10 min×3 次，加入配制好的ECL 發(fā)光液，避光孵育5 min，化學發(fā)光凝膠成像儀中采集圖片信息，圖片用Image pro plus 6.0 軟件進行灰度分析。每個實驗結果獨立重復3 次。

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學處理；正態(tài)分布計量資料以均數±標準差表示，多組計量資料間比較采用ANOVA 檢驗，組內兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR?199a 在肺癌細胞中的表達高于正常肺上皮細胞正常肺上皮細胞BEAS?2B 中miR?199a的相對表達量為（0.83±0.04），NSCLC 細胞A549中miR?199a 的相對表達量為（0.31±0.02），顯著低于正常肺上皮細胞內的表達（P<0.05）。見圖1。

圖1 RT?PCR 檢測正常肺上皮細胞BEAS?2B 和NSCLC細胞A549 內miR?199a 的表達Fig.1 RT?PCR detection of miR?199a expression in normal lung epithelial cells BEAS?2B and non?small cell lung cancer cells A549

2.2 miR?199a 能抑制NSCLC 細胞的增殖自轉染48 h 起，mimics 組細胞增殖活力顯著低于其他兩組（P< 0.05），而inhibitor 組細胞的增殖活力在3 組中最高（P< 0.05），這種趨勢一直持續(xù)至96 h。見圖2。

圖2 CCK8 法檢測miR?199a 對A549 細胞增值率的影響Fig.2 CCK8 assay to detect the effect of miR?199a on the proliferation rate of A549 cells

2.3 miR?199a能促進NSCLC細胞的凋亡細胞轉染48 h后，inhibitor組細胞凋亡率為（3.32±0.44）%，NC組細胞凋亡率為（13.93±0.73）%，mimics 組細胞凋亡率為（25.10±0.56）%。其中inhibitor 組凋亡率低于其他兩組（P< 0.05），mimics 組細胞凋亡率顯著高于其他兩組（P<0.05）。見圖3。

圖3 PITC/PI 聯合流式細胞儀檢測miR?199a 對A549 細胞凋亡率的影響Fig.3 PITC/PI combined with flow cytometry to detect the effect of miR?199a on the apoptosis rate of A549 cells

2.4 miR?199a 能抑制細胞遷移和侵襲劃痕實驗檢測miR?199a 對A549 細胞遷移能力的影響，結果顯示，24 h 后mimics 組細胞劃痕寬度為0 h的（28.74±1.26）%，NC 組為（63.63±3.22）%，顯著高于mimics 組（P< 0.05），inhibitor 組為（93.48±2.88）%，在3 組中為最高（P<0.05），見圖4。

Transwell 小室實驗檢測miR?199a 對A549 細胞侵襲能力的影響，結果顯示，mimics 組單位面積內穿過小室纖維膜細胞數為（98.83±9.70）個，NC 組單位面積內穿過小室纖維膜細胞數為（27.39±4.66）個，顯著低于mimics 組（P< 0.05），inhibitor組單位面積內穿過小室纖維膜細胞數為（11.86±2.01）個，顯著低于其他兩組（P<0.05），見圖5。

圖4 劃痕實驗檢測不同組別細胞遷移能力Fig.4 Scratch test to detect cell migration ability in different groups

圖5 Transwell 小室實驗檢測miR?199a 對A549 細胞侵襲能力的影響Fig.5 Transwell chamber experiment to detect the effect of miR?199a on the invasion ability of A549 cells

2.5 miR?199a 靶向抑制A549 細胞中Wnt3a 的表達為了確定miR?199a 在A549 細胞中發(fā)揮生物學功能的靶向作用點，筆者使用TargetScan 軟件篩選miR?199a 潛在下游靶向蛋白，預測發(fā)現miR?199a 與Wnt3a 保守位點有高分數結合（圖6A），Wnt3a 為miR?199a 的一個潛在作用靶點。本研究雙熒光素酶報告系統(tǒng)結果顯示，miR?199a?mimics抑制了A549 細胞中Wnt3a?3′?UTR?WT 報告基因的熒光素酶活性，而miR?199a?Inhibitor 刺激了Wnt3a?3′?UTR?WT 報告基因的熒光素酶活性，差異具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），而在轉染突變載體的細胞內沒有觀察到熒光素酶活性改變，表明Wnt3a是miR?199a 的直接靶向蛋白見（6B）。同時，用Western blot 檢測了miR?199a 表達不同的細胞內Wnt3a 的蛋白表達情況，結果顯示轉染了miR?199a mimics的細胞內Wnt3a的表達顯著低于轉染空白質粒組細胞（P< 0.05），而轉染miR?199a 抑制劑的細胞內Wnt3a 的表達顯著高于其他兩組（P<0.05，圖6C、D）。

圖6 miR?199a 靶基因確定Fig.6 Identification of miR?199a target gene

2.6 miR?199a 能刺激A549 細胞內E?cadherin 表達，抑制Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin的蛋白表達Western blot 檢測轉染不同質粒的A549 細胞中Wnt 信號通路中相關蛋白的表達，結果顯示，轉染miR?199a 類似物的細胞中，E?cadherin 表達顯著高于NC 組細胞，而Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin 的表達低于NC 組細胞，差異均具有統(tǒng)計學意義（P< 0.05），轉染miR?199a 抑制劑的細胞內，E?cadherin 表達低于NC 組細胞，而Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin 的表達高于NC 組細胞，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖7。

3 討論

miR?199a 被證實在多種腫瘤細胞中作為癌基因或抑癌基因異常表達，同時調控腫瘤細胞的生物學行為［5-6］。研究發(fā)現，相對于正常組織，miR?199a 在肝癌、膀胱癌、食管癌等多種腫瘤細胞內的表達明顯低于正常組織，miR?199a表達增加后，腫瘤細胞的增殖、生長受到抑制，凋亡率顯著增加［7-8］，說明miR?199a 在這些腫瘤組織內發(fā)揮抑制基因的作用。SAKAGUCHI 等［9］研究發(fā)現，miR?199a 通過靶向作用ITGA3 抑制膀胱癌細胞的轉移侵襲；ZHOU 等［10］的實驗結果顯示miR?199a 通過CCR7調控膀胱癌細胞的上皮間質轉化（EMT）過程，發(fā)揮抑癌基因的作用；PHATAK等［11］報道稱miR?199a?3p通過靶向p21 激酶4 降低食管癌細胞增殖活性。本研究為了探討miR?199a 對NSCLC 細胞的生物學功能是否有調控作用，首先檢測了其在正常肺上皮細胞和NSCLC 細胞中的表達，結果顯示，miR?199a在NSCLC 細胞中的表達明顯低于正常肺上皮細胞，同時，本研究檢測了miR?199a 表達程度不同的A549 細胞的生物活性，結果顯示，過表達miR?199a的細胞增殖、轉移和侵襲活性均顯著低于低表達miR?199a 的細胞，而凋亡率顯著上升，而低表達miR?199a 的細胞增殖、轉移和侵襲活性增強，凋亡率下降，以上結果提示miR?199a 在NSCLC 中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。

為了進一步探究miR?199a 對NSCLC 細胞的作用機制，筆者在miRNA 數據查詢發(fā)現Wnt3a 3′?UTR 中存在其目標堿基序列。Wnt/β?catenin 信號通路在腫瘤細的增殖、凋亡及間質化過程中發(fā)揮重要作用，該通路的異常激活與多種癌癥的發(fā)生有密切關系，其中Wnt3a 是該通路的重要配體之一［12］，多項研究顯示，Wnt3a 參與了NSCLC 的病理過程，YU 等［13］證實CSF?1R 通過Wnt3a 信號傳導調節(jié)NSCLC 細胞的擴散；HAN 等［14］發(fā)現銀杏外種皮提取物通過Wnt 3a/β?catenin 信號通路抑制Lewis 肺癌發(fā)生。本研究中，用雙熒光素酶報告實驗證實miR?199 可明顯減弱野生型Wnt3a3′?UTR的熒光酶活性，而對突變型Wnt3a3′?UTR 的熒光酶活性無影響，同時，轉染miR?199a 類似物的細胞內Wnt3a 的蛋白水平顯著低于轉染miR?199a 抑制序列的細胞，提示miR?199a 可靶向抑制Wnt3a的表達。

為了進一步研究miR?199a 對NSCLC 細胞調控作用的分子機制，本研究在3 組miR?199a 不同表達的A549 細胞中檢測了一系列Wnt3a/β?catenin 信號通路的下游分子。當Wnt 信號通路被異常激活時，β?catenin 在細胞內逐漸聚集，繼而進入細胞核內聚集，激活下游一系列靶基因的表達，既往研究［15］表明，β?catenin 在A549 細胞中高表達，對維持A549 細胞增殖和克隆形成能力有促進作用。本研究結果發(fā)現，隨著Wnt3a 在miR?199a?mimics組細胞中被抑制，β?catenin 的表達也隨之減弱，同時，miR?199a?inhibitor 組細胞內β?catenin 表達較miR?199a?NC 組顯著增加。C?myc 是Wnt/β?catenin通路的一個下游靶基因，其在細胞周期、細胞增殖過程中能使細胞無限增殖，獲得永生化能力，并且能促進細胞分裂［16-17］。Survivin 是Wnt/β?catenin 通路的另一個靶基因，主要表達于胚胎組織及腫瘤細胞中，屬于凋亡抑制蛋白，其主要在細胞周期的G2/M 期發(fā)揮作用，通過抑制caspase?3 的活性而阻斷細胞的凋亡［18-19］。本研究結果發(fā)現，miR?199a能抑制A549 細胞內C?myc、Survivin 的表達，提示miR?199 對A549 細胞增殖、凋亡的影響可能是通過Wnt/β?catenin 通路對C?myc、Survivin 的調控而實現的。

EMT 指源于上皮的腫瘤細胞失去極性而向具有間質表型細胞轉化的過程，在此過程中，上皮細胞黏附性降低，極性消失，使細胞的轉移和侵襲能力增強［20-21］，Wnt/β?catenin 信號通路是導致EMT的重要因素［22］，EMT過程的重要標志是細胞內上皮細胞的主要成分上皮型鈣黏蛋白（E?cadherin）表達下降，間質細胞的主要成分波形蛋白（Vimentin）等能刺激細胞移動的蛋白表達上調，二者都為Wnt/β?catenin信號通路的下游蛋白［23-25］。本研究檢測了miR?199a 對E?cadherin、Vimentin 表達的影響，結果發(fā)現，miR?199a 能抑制二者在A549 細胞中的表達，這種抑制作用可能是通過對Wnt/β?catenin通路活性的下調而實現的，同時也進一步解釋了miR?199a 對A549 細胞的遷移、侵襲活性下調的分子機制。

本研究探討了miR?199a 對NSCLC 細胞生物學活動的調控作用，并對其作用機制進行了初步探討，不足之處在于范圍只限于細胞水平，而未進行體內實驗。本課題組在下一步的研究中會探究miR?199a 在NSCLC 組織中的表達及其與臨床病理特征間的關系，為miR?199a 在非小細胞肺腺癌中發(fā)揮作用提供更充足的證據。綜上所述，miR?199a能抑制NSCLC A549 的增殖、遷移和侵襲，同時刺激其凋亡，這種作用可能是通過靶向抑制Wnt3a/β?catenin 信號通路的活性而實現的。

圖7 Western blot 檢測miR?199a 對A549 細胞內E?cadherin、Vimentin、β?catenin、C?myc、Survivin 的蛋白表達Fig.7 Western blot detected miR?199a protein expression of E?cadherin，Vimentin，β?catenin，C?myc，and Survivin in A549 cells