張方圓，齊 越，原美茹，任建平，劉永學(xué)

(軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

琥珀酸G 蛋白偶聯(lián)受體91(G protein-coupled receptor 91，GPR91)是G 蛋白偶聯(lián)受體(G proteincoupled receptor，GPCR)成員之一，但其內(nèi)源性配基有別于傳統(tǒng)GPCR[1]，為三羧酸循環(huán)的一個中間產(chǎn)物-琥珀酸(鹽)。該受體分布于多種器官組織，可在琥珀酸介導(dǎo)下調(diào)控炎癥因子的產(chǎn)生[2]，參與腎素釋放的調(diào)節(jié)并導(dǎo)致血壓升高，已有研究結(jié)果顯示，心臟組織中亦存在GPR91的表達(dá)，提示GPR91很可能與心臟功能密切相關(guān)，心肌細(xì)胞低氧時GPR91可被激活[3-7]。低氧環(huán)境會對心肌組織造成損傷，破壞電平衡和心肌收縮功能[3-4]，在患有心肌肥大的患者及各種心肌損傷動物模型中均可見鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMK Ⅱ)的上調(diào)，B 型尿鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)為臨床上常見的判定心肌肥大的標(biāo)志物。本實驗將CaMK Ⅱ及BNP作為判定心肌損傷的標(biāo)志，通過研究常氧、低氧環(huán)境下GPR91與相關(guān)信號分子的變化，為GPR91作為心肌缺氧性疾病防治靶點(diǎn)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清、PBS、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco)，膠原酶Ⅱ、DNA 酶Ⅰ、磷酸酶抑制劑(Solarbio)，琥珀酸鹽(Succinate，Suc)和5-溴脫氧尿苷(5-bromo-2′-deoxyuridine，BrdU)(Sigma)，蛋白酶抑制劑(Cwbio)，抗β-actin 兔多克隆抗體(Cell Signaling Technology)， 羊 抗 兔 二 抗 (Abcam)， siRNA 試 劑 盒(Ribobio)。

潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，XH-89型渦旋振蕩器(浙江樂成電器廠)，臺式高速離心機(jī)(Sigma)，BS200s-WEI 臺式天平(北京賽多利斯天平有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)，低氧培養(yǎng)小室(Stem Cell)。

1.2 實驗方法

1.2.1 新生大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)取出生24 h 內(nèi)的SD乳鼠，浸于75%乙醇中消毒1 min后置于潔凈工作臺，開胸后快速取心臟并放入預(yù)冷的PBS 中清洗兩遍，然后將心肌組織剪成1 mm3的細(xì)小組織塊。加入0.06%的胰酶，消化2 min 后棄去液體，隨即加入3 mL 0.05%的膠原酶置于恒溫水浴鍋中37 ℃消化5 min。重復(fù)消化過程3～4 次，直至瓶內(nèi)組織塊完全消失。加入含有15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，將消化液過濾后移入離心管，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，使用完全培養(yǎng)基DMEM 重懸細(xì)胞，吹打混勻后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中90 min。顯微鏡下觀察，可見成纖維細(xì)胞已貼壁，圓形心肌細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中還未貼壁，吸取細(xì)胞懸液，使用血球細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后，加入抑制成纖維生長的BrdU，然后按每孔1×106個細(xì)胞的密度接種于6 孔板中，放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每24 h 換液一次，72 h后可見心肌細(xì)胞成片搏動。

1.2.2 siRNA干擾GPR91在原代心肌細(xì)胞中的表達(dá)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)大小正常，心肌搏動有節(jié)律，可用于siRNA 干擾技術(shù)操作。具體步驟按照銳博生物提供的siRNA(即用型化學(xué)合成雙鏈小分子RNA)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。對6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行分組，隨機(jī)分為陰性對照組(CTL，不作任何處理)、CTL＋siGPR91(100 μmol/L)組、Suc(200 μmol/L)組、Suc(100 nmol/L)＋siGPR91(200 μmol/L)組、低氧CTL組、低氧CTL＋siGPR91(200 μmol/L)組、低氧Suc(200 μmol/L)組和低氧Suc(200 μmol/L)＋siGPR91(200 μmol/L)組。干擾48 h 后使用Western blot 法檢測干擾效果。

1.2.3 制備原代心肌細(xì)胞低氧模型低氧培養(yǎng)小室為獨(dú)立、密閉、滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)小室，可放入現(xiàn)有的實驗室培養(yǎng)箱中與其他細(xì)胞共同培養(yǎng)。我們將原代心肌細(xì)胞進(jìn)行siRNA 及分組給藥處理后，將其放入已經(jīng)消毒好的細(xì)胞培養(yǎng)小室，小室底部使用無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿盛放高壓滅菌蒸餾水，完全密封后，通入體積分?jǐn)?shù)為10%氧、5%二氧化碳及85%氮?dú)獾幕旌蠚怏w，將氣體速率控制在20 L/min，充氣10 min使混合氣體完全充滿小室。拔掉通氣管，使用75%乙醇消毒小室表面后放入37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱。本實驗采用10%的氧含量下低氧培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)胞的搏動次數(shù)及形態(tài)改變。最后提取心肌細(xì)胞總蛋白，通過Western blot 法檢測心肌損傷相關(guān)蛋白(GPR91、BNP及CaMKⅡ)的表達(dá)。

1.2.4 CCK-8 檢測心肌細(xì)胞存活率原代心肌細(xì)胞以1×104/mL 的密度接種于96 孔板中，分組給藥及siRNA 處理后置于低氧小室培養(yǎng)5 d，取出心肌細(xì)胞向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液(避免產(chǎn)生氣泡)。然后將96孔板放入低氧小室并充入混合氣體隨即于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定D(450)值。

1.2.5 檢測原代心肌細(xì)胞低氧模型的ATP 含量本實驗全程在冰上操作。取出在低氧小室培養(yǎng)5 d 的原代心肌細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，然后使用移液槍每孔加入100 μL 裂解液；冰上裂解，12 000 g 離心 5 min 后，取上清。使用ATP檢測裂解液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；在標(biāo)準(zhǔn)品及樣品孔內(nèi)加入100 μL的檢測工作液，室溫放置3～5 min，然后分別在標(biāo)準(zhǔn)品及樣本孔內(nèi)加入20 μL標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品，迅速混勻，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度D(450)值。

1.2.6 Western blot 檢測相關(guān)目的蛋白的表達(dá)變化取出各組原代心肌細(xì)胞，全程置于冰上操作。加入預(yù)冷蛋白裂解液提取蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白含量；各取20 μL 蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下脫脂牛奶封閉3 h，4 ℃條件下一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌5 次，每次5 min，二抗搖床室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗滌，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件。數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK檢驗。不符合方差齊性者采用 Welch方差分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測siRNA干擾效果

Western blot檢測GPR91蛋白表達(dá)結(jié)果見圖1。與CTL 組比較，CTL+siGPR91 組 GPR91 蛋白表達(dá)明顯降低，差異具體統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明siRNA干擾成功，可進(jìn)行后續(xù)實驗操作。

圖1 Western blot檢測siRNA干擾效果

2.2 CCK-8法檢測心肌細(xì)胞存活率

原代心肌細(xì)胞的存活情況如圖2 所示，常氧環(huán)境下，與CTL 組相比，CTL+siGPR91 組心肌細(xì)胞存活率未見明顯差異，加入琥珀酸后，細(xì)胞存活率出現(xiàn)降低(P＜0.05)，Suc+siGPR91組細(xì)胞存活率較Suc組升高(P＜0.05)；低氧環(huán)境下，細(xì)胞存活率較常氧環(huán)境明顯降低，與CTL 組相比，CTL+siGPR91 組細(xì)胞存活率升高(P＜0.05)，Suc 和 Suc+siGPR91 組細(xì)胞存活率明顯降低(P＜0.05)；Suc+siGPR91組細(xì)胞存活率較Suc組升高(P＜0.05)。

圖2 原代心肌細(xì)胞的存活情況(xˉ±s，n=3)

2.3 原代心肌細(xì)胞低氧模型細(xì)胞的ATP含量

原代心肌細(xì)胞的ATP 含量見圖3。常氧環(huán)境下，各實驗組細(xì)胞ATP含量未見明顯變化，各組ATP含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。低氧環(huán)境下，CTL+siGPR91組及CTL 組細(xì)胞ATP 含量較常氧組出現(xiàn)下調(diào)，但組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；而Suc組及Suc+siGPR91組細(xì)胞ATP含量較CTL組明顯升高(P＜0.01)。

圖3 原代心肌細(xì)胞的ATP含量(xˉ±s，n=3)

2.4 原代心肌細(xì)胞低氧模型中GPR91、BNP 及CaMKⅡ蛋白的表達(dá)變化

Western blot 檢測結(jié)果見圖4。常氧時CLT+siGPR91 組細(xì)胞GPR91 較CLT 組表達(dá)減弱，說明干擾成功；Suc+siGPR91 組細(xì)胞GPR91 表達(dá)較Suc 組明顯降低(P＜0.01)。低氧環(huán)境下，CLT+siGPR91 組細(xì)胞GPR91表達(dá)較CLT組減弱，Suc及Suc+siGPR91組細(xì)胞較CLT組明顯增加(均為P＜0.01)。

常氧時CTL+siGPR91組細(xì)胞BNP表達(dá)較CTL組出現(xiàn)明顯下調(diào)，加入200 μmol/L Suc 后，Suc 組細(xì)胞的BNP 表達(dá)較 CTL 組明顯上調(diào)(P＜0.01)，Suc+siGPR91組細(xì)胞BNP 表達(dá)較CTL 組增加，而Suc+siGPR91 組BNP較Suc組出現(xiàn)降低(P＜0.05)；低氧環(huán)境下，總體較常氧環(huán)境下BNP的表達(dá)出現(xiàn)明顯的增加，CTL+siGPR91組BNP 表達(dá)較 CTL 組減少，Suc 組較 CTL 組表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，Suc+siGPR91組BNP表達(dá)較CTL組也出現(xiàn)增加(P＜0.01)，與 Suc 組相比，Suc+siGPR91 組 BNP 表達(dá)也出現(xiàn)降低(P＜0.05)。

常氧環(huán)境下，Suc 及Suc+siGPR91 組細(xì)胞的CaMKⅡ表達(dá)明顯較CTL組降低(P＜0.01)，與Suc組比較，可見Suc+siGPR91 組細(xì)胞CaMKⅡ隨著GPR91 的敲低出現(xiàn)減少(P＜0.01)，說明GPR91 可能對其造成影響；低氧環(huán)境下，較常氧環(huán)境總體CaMKⅡ表達(dá)明顯增加，與CTL 組比較，CTL+siGPR91 組細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)，Suc 組和Suc+siGPR91 組CaMKⅡ表達(dá)顯著的增多 (P＜0.01)， 與 Suc 組 相 比 ， Suc+siGPR91 組 細(xì) 胞CaMKⅡ表達(dá)降低(P＜0.01)。

圖4 原代心肌細(xì)胞低氧模型中GPR91、BNP及CaMK Ⅱ蛋白的表達(dá)變化(xˉ±s，n=3)

2.5 GPR91對PI3K/Akt通路的影響

Western blot 檢測結(jié)果見圖5。常氧環(huán)境下，CTL、CTL+siGPR91 組細(xì)胞Akt 的表達(dá)未見明顯變化，加入 200 μmol/L 琥珀酸后，Suc 較 CTL 組的 Akt 表達(dá)增加，Suc+siGPR91 組 Akt 的表達(dá)較 CTL 組升高(P＜0.05)，但Suc+siGPR91組較Suc組相比，Akt表達(dá)減少(P＞0.05)；低氧環(huán)境下，Akt的蛋白表達(dá)較常氧情況出現(xiàn)明顯的上調(diào)，CTL+siGPR91 組Akt 的表達(dá)較CTL 組降低(P＜0.05)，加入200 μmol/L琥珀酸，Suc組、Suc+siGPR91 組Akt 的表達(dá)較CTL 組明顯增加，Suc+siGPR91組較Suc組相比，Akt表達(dá)減少(P＜0.01)。

常氧環(huán)境下，CTL+siGPR91 組細(xì)胞的P-Akt 表達(dá)較CTL 組降低；加入200 μmol/L 琥珀酸后，Suc 組的P-Akt表達(dá)較CTL組降低，Suc+siGPR91組較CTL組也出現(xiàn)明顯的降低(P＜0.01)；低氧培養(yǎng)后，與CTL 組相比，CTL+siGPR91組P-Akt的表達(dá)降低(P＜0.01)；加入200 μmol/L琥珀酸后，Suc及Suc+siGPR91組的P-Akt表達(dá)較 CTL 組增加(P＜0.01)；Suc+siGPR91 組 P-Akt 的表達(dá)較Suc組減少(P＜0.01)。

3 討 論

圖5 原代心肌細(xì)胞低氧模型中GPR91對Akt磷酸化的影響(xˉ±s，n=3)

為探討GPR91是否參與心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制，我們選用siRNA技術(shù)干擾GPR91的表達(dá)，Western blot法檢測干擾效果，可達(dá)到50%的抑制率，說明干擾成功，為下游信號分子通路的研究提供了基礎(chǔ)。低氧培養(yǎng)小室具有獨(dú)立、密閉性良好的特點(diǎn)，可直接放入現(xiàn)有實驗室的細(xì)胞培養(yǎng)箱與其他細(xì)胞共同培養(yǎng)。初期實驗設(shè)置體積分?jǐn)?shù)為1% O2、94% N2和5% CO2的混合氣體，模擬急性低氧環(huán)境，觀察心肌損傷。接近無氧培養(yǎng)6 h 后，可見心肌細(xì)胞消失自主搏動，心肌間隙變寬，更有大片心肌細(xì)胞變形，胞核破裂，造成心肌細(xì)胞50%以上的死亡率。隨即更改實驗條件，更換體積分?jǐn)?shù)為10% O2、5% CO2及85% N2的混合氣體組分，模擬高原環(huán)境下氧含量，低氧培養(yǎng)5 d，每隔1 d 換液，可在顯微鏡下觀察到實驗第1天心肌細(xì)胞搏動稍有增快，心肌細(xì)胞形態(tài)較CTL未見明顯變化；低氧環(huán)境下培養(yǎng)3 d后可在顯微鏡下觀察到心肌細(xì)胞搏動減慢，心肌細(xì)胞間隙增寬，并且可見個別心肌細(xì)胞變形，停止搏動；完成低氧環(huán)境下培養(yǎng)5 d后，鏡下可見心肌細(xì)胞跳動明顯變緩，加入200 μmol/L琥珀酸實驗孔，可見細(xì)胞變形、腫脹，大片未見梭形正常形態(tài)的心肌，搏動變慢。表明，低氧對心肌細(xì)胞形態(tài)和基本生理功能造成影響。CCK-8檢測心肌細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)，低氧各組較常氧組的存活率降低，其中干擾GPR91后可出現(xiàn)存活率上升(P＜0.05)。說明GPR91可能參與了低氧性心肌損傷的病理過程。

在患有心肌肥大的患者及各種心肌損傷動物模型中均可見CaMKⅡ表達(dá)的上調(diào)，且心肌損傷大鼠模型常伴有心律失常、心腔擴(kuò)大及猝死的表征[8]，說明CaMKⅡ在心肌疾病的發(fā)生、發(fā)展中有重要價值。BNP為臨床上常見的判定心肌肥大的標(biāo)志物，本部分實驗將CaMKⅡ及BNP作為判定心肌損傷的標(biāo)志。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PI3K 可介導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng)，其中PI3K/Akt可調(diào)節(jié)心肌結(jié)構(gòu)，造成心肌肥大[9-11]。琥珀酸鹽是檸檬酸循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，缺血及低氧環(huán)境下血液中Suc 水平升高[12-14]，本實驗中Western blot結(jié)果顯示，常氧情況下，干擾GPR91 后，BNP、CaMKⅡ及Akt表達(dá)減少，其中BNP較CTL組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明正常情況下，GPR91對CaMKⅡ及Akt 的影響較小。加入200 μmol/L 琥珀酸后，BNP蛋白的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，但對CaMKⅡ及Akt的影響較小，未見明顯變化。常氧環(huán)境下，加入200 μmol/L琥珀酸，BNP、CaMKⅡ的表達(dá)Suc+siGPR91 組較Suc組有減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。低氧情況，干擾GPR91 表達(dá)后，可見CTL+siGPR91 組的BNP、CaMKⅡ及Akt 表達(dá)水平較CTL 下調(diào)，且差異均有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 (P＜0.05)， Suc+siGPR91 組 和 Suc 組BNP、CaMKⅡ及Akt 的蛋白表達(dá)水平相比CTL 組均明顯增加(P＜0.05)，但 Suc+siGPR91 組較 Suc 組降低(P＜0.05)，說明GPR91可能在低氧心肌細(xì)胞損傷中對BNP及CaMKⅡ產(chǎn)生影響。敲低GPR91 的表達(dá)后可使Akt的磷酸化水平降低，推測GPR91 可能通過激活A(yù)kt 的磷酸化參與心肌損傷的病理過程。預(yù)示著GPR91可以作為心肌缺氧損傷的干預(yù)分子，具有藥物防治靶點(diǎn)的潛在價值。