蔡 穎，李閏冰 ，鄭 凱，秦雙建 ，李柏茹 ，張朝暉，徐新云

(1．深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳518055；2．南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽 421001；3．中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙 410078)

隨著中國城市化進程快速發(fā)展，霧霾作為一種災(zāi)害性天氣現(xiàn)象，已經(jīng)成為影響大眾健康的公共衛(wèi)生問題。大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是霧霾的主要成分之一，PM2.5憑借粒徑小和表面積大等優(yōu)勢，能較長時間懸浮在空氣中，并能隨著呼吸道進入肺泡，誘發(fā)許多呼吸系統(tǒng)疾病[1]。多項研究發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)生率的增加與大氣中PM2.5的濃度上升有很大關(guān)系[2-3]。呼吸系統(tǒng)是PM2.5暴露和發(fā)揮作用的主要靶器官，我國工業(yè)化發(fā)展的同時也伴隨著PM2.5濃度的不斷上升，對人類健康構(gòu)成了重大威脅，因此，探索PM2.5對呼吸系統(tǒng)損害的分子機制對于呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療具有重要意義[4-6]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在生物發(fā)育過程中起著重要的基因調(diào)控作用，microRNA(miRNA)一直是非編碼RNA中的研究熱點，可以在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。許多研究表明，miRNA表達失調(diào)在PM2.5誘導(dǎo)呼吸系統(tǒng)疾病中起著重要作用，包括哮喘[7]，肺癌[8]等。miRNA 還被證明與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤進展中的一個關(guān)鍵形態(tài)學變化，研究報道了A549 細胞暴露于PM2.5后誘發(fā)EMT，當敲除miR-32后顯著增強Smad1介導(dǎo)的信號通路活性，增強了細胞的遷移和侵襲能力，促進EMT 進程[10]。由此可見，miRNA在PM2.5介導(dǎo)機體發(fā)生損傷的過程中起著重要的調(diào)控作用。因此，本文選取HBE 細胞作為實驗對象，分析PM2.5暴露后是否引起HBE 細胞中的miRNA 表達改變，以及利用生物信息學方法篩選差異miRNAs，并進行功能富集分析，篩選關(guān)鍵miRNAs 及靶基因，從而在非編碼RNA 研究領(lǐng)域為PM2.5致HBE 細胞損傷的分子機制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBE細胞購于中國上海細胞庫，PM2.5樣品來源于山西省太原市，DMEM 培養(yǎng)基購于Hyclone 公司。胎牛血清(FBS)、0.25% Trpsin-EDTA 購于美國Gibco公司。

1.2 PM2.5采集與處理

使用TH-150CⅢ型中流量大氣采樣器(武漢市天虹儀器有限責任公司)采集PM2.5樣品，采樣地點選擇煤炭消耗大省山西太原市，采樣流速100 L/min，每次采樣時間24 h。將吸附有PM2.5的濾膜剪成2 cm×2 cm放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，用一層錫箔紙使燒杯口密封，超聲振蕩30 min，去除燒杯中殘留的濾膜，制成PM2.5懸濁液，于-80 ℃條件下冷凍24 h。然后將樣品置于真空冷凍干燥機中干燥24 h，至PM2.5完全干燥后用紫外燈滅菌1～2 h，用超純水溶解PM2.5顆粒后制成PM2.5儲備液，分裝后于-20 ℃保存待用，使用前振蕩混勻。

1.3 細胞培養(yǎng)與PM2.5染毒

將HBE細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的溫箱中傳代培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期時，以未處理組作為對照組，根據(jù)前期實驗研究，PM2.5染毒HBE 細胞的IC50為70.12 mg/mL，因此采用50 mg/mL 的PM2.5染毒濃度作為實驗組(以下稱PM2.5組)，于不含胎牛血清及雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基中進行PM2.5染毒培養(yǎng)，每組一式3份準備miRNA測序。

1.4 構(gòu)建cDNA文庫及miRNA測序

高通量測序(illumina HiSeqTM2500/MiSeq 測序平臺)檢測RNA 樣品中miRNA 的表達情況，由天津諾禾致源生物信息科技有限公司完成。大致流程為：①RNA樣品檢測。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop 檢測RNA 的純度[D(260)/D(280)比 值]； Qubit 對 RNA 濃 度 進 行 精 確 定 量 ；Agilent 2100 精確檢測RNA 的完整性。②使用Small RNA Sample Pre Kit 構(gòu)建文庫。③使用Qubit2.0 進行初步定量后，采用qPCR 方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度＞2 nmol/L)，以保證文庫質(zhì)量。④把不同濃度文庫按照不同比例混合后進行HiSeq/MiSeq測序。

1.5 miRNA差異表達分析

使用熱圖進行層次聚類分析以顯示樣品之間差異miRNA表達量的聚類模式。

用火山圖可以推斷差異表達miRNA的整體分布情況，從差異倍數(shù)(fold change)和校正后的P值兩個水平進行評估，按照調(diào)整后P＜0.05 的標準篩選差異表達miRNAs。

1.6 miRNA功能預(yù)測

由miRanda和RNAhybrid兩個軟件預(yù)測miRNAs的靶基因，對每組差異表達miRNAs 的靶基因的集合進行富集分析。Gene Ontology(http://www.geneontology.org/)是基因功能國際標準分類體系，從生物學過程、細胞組分和分子功能3 個方面對靶基因進行功能注釋，KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關(guān)信號通路的主要公共數(shù)據(jù)庫，能確定候選靶基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.7 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

miRNAs 與靶基因及靶基因之間的相互作用關(guān)系構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖為：①采用Cytoscape 軟件對miRNAs 及其相應(yīng)的靶基因間的相互作用關(guān)系繪制成可視化網(wǎng)絡(luò)圖。篩選與靶基因相互作用數(shù)量較多的miRNAs 作為核心miRNAs。②利用STRING在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶基因間的相互作用關(guān)系，再由Cytoscape繪制成網(wǎng)絡(luò)圖。篩選其中相互作用數(shù)量超過10個節(jié)點的靶基因作為核心靶基因。

2 結(jié) 果

2.1 PM2.5暴露導(dǎo)致HBE細胞內(nèi)miRNAs表達譜改變

PM2.5組和對照組HBE 細胞miRNA 高通量測序結(jié)果見圖1。兩組分別檢測到1 021和927個miRNA，兩組取交集得811 個miRNAs。根據(jù)調(diào)整后P＜0.05 篩選標準，有27 個miRNAs 發(fā)生差異表達，其中7 個miRNAs 表達上調(diào)，20 個miRNAs 表達下調(diào)。miR-372-3p 上調(diào)倍數(shù)最大，F(xiàn)C 為 1.94；miR-223-3p 下調(diào)程度最大，F(xiàn)C 為0.11。火山圖和熱圖展示了27 個差異miRNAs的分布情況，見圖2。差異倍數(shù)較大的前15個miRNAs見表1。

圖1 PM2.5染毒組和對照組HBE細胞中miRNA測序結(jié)果

圖2 miRNAs表達譜分布圖

2.2 miRNAs功能富集分析

應(yīng)用GO和KEGG 富集分析來預(yù)測差異miRNAs 的功能，結(jié)果見圖3 和圖4。GO 分析結(jié)果顯示，差異miRNAs 主要參與細胞代謝、蛋白質(zhì)代謝等生物學過程，如單一生物代謝過程、代謝過程等。細胞組分主要集中在胞內(nèi)如細胞質(zhì)、細胞器等。對于分子功能，差異miRNAs主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)結(jié)合、催化活性等。

表1 前15個差異表達miRNAs

為了分析PM2.5致HBE細胞損害的潛在機制，采用KEGG 數(shù)據(jù)庫對靶基因參與調(diào)控的信號通路及途徑進行分析。結(jié)果顯示，代謝途徑、PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等途徑可能是PM2.5發(fā)揮毒性作用的潛在途徑。

2.3 相互作用關(guān)系分析

圖3 候選靶基因GO富集柱狀圖

圖4 候選靶基因KEGG富集散點圖

圖5 miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.1 miRNAs-靶基因相互作用對miRNAs 進行功能預(yù)測得到miRNA參與調(diào)控的生物學過程及相關(guān)信號通路，再利用可視化軟件展現(xiàn)miRNAs 及其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，見圖5。一個miRNA 可以調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可以由多個miRNA調(diào)控。將與靶基因相互作用數(shù)量較多的miRNA(上調(diào)5個，上調(diào)6個)作為核心miRNAs，繪制核心miRNAs-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，上調(diào)核心miRNAs為：miR-371b-3p、miR-371a-5p、miR-27a-3p、miR-7-5p、miR-372-3p，其中miR-371b-3p調(diào)控靶基因最多。下調(diào)核心 miRNAs 為 miR-145-5p、miR-133a-3p、miR-204-5p、miR-125b-5p、miR-486-5p、miR-512-3p，其中miR-145-5p調(diào)控靶基因最多。

2.3.2 靶基因相互作用將上調(diào)和下調(diào)差異miRNA的靶基因分別輸入STRING 在線數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape 可視化軟件對所得TSV 文件數(shù)據(jù)繪制網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。并篩選由下調(diào)miRNAs 調(diào)控的3個相互作用節(jié)點大于10 的核心基因，為血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、絲裂原激活的蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)和 CC 趨化因子受體 5 型(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)。

3 討 論

圖6 靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

在過去的幾十年里，miRNAs 已經(jīng)越來越為人們所廣泛研究[11-12]。miRNA 是一種高度保守的小型非編碼RNA。通過與靶mRNA 的3′非編碼區(qū)堿基互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，發(fā)揮其生物學功能。miRNAs 能通過抑制翻譯或者降解靶基因來維持細胞代謝、細胞凋亡、蛋白質(zhì)合成等正常生理過程[13]，在異常表達情況下，miRNA 既能充當致癌基因也能作為抑癌基因[14-15]。有許多研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露能導(dǎo)致miRNAs 表達譜的改變[16]，為呼吸系統(tǒng)疾病的分子機制研究提供了新的方向。

利用Illumina 測序平臺，快速、高效地讀取高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)。我們在PM2.5組和對照組分別檢測到1 021 和 927 個 miRNA。按照調(diào)整后P＜0.05 篩選條件，我們共篩選到27 個差異miRNAs，包括7 個上調(diào)miRNAs和20個下調(diào)miRNAs。對靶基因進行富集分析顯示，差異miRNAs 主要參與代謝途徑、PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PI3K-AKT 信號通路是細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛參與了細胞增殖、代謝及死亡等生命過程，在腫瘤發(fā)展進程中起著重要的調(diào)控作用[17]。膠質(zhì)瘤細胞中MRPS16(線粒體核糖體蛋白S16)過表達通過激活PI3K-AKT 信號通路促進Snail 的表達，從而促進腫瘤的進展[18]。MAPK 信號途徑是涉及細胞增殖、分化及凋亡等生物學過程的關(guān)鍵途徑，已有許多證據(jù)表明了MAPK 信號途徑失控與多種惡性腫瘤包括肺癌的發(fā)展、診斷及預(yù)后的相關(guān)性[19]。Soleimani 等[20]發(fā)現(xiàn)Ras/MAPK 信號通路中的miRNAs 在大腸癌細胞增殖、凋亡等過程中起著重要作用。

我們分別對上下調(diào)表達差異miRNAs 及其預(yù)測的靶基因構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示，共鑒定11個核心miRNAs，含上調(diào)5 個：miR-371b-3p、miR-371a-5p、miR-27a-3p、miR-7-5p、miR-372-3p，其中miR-371b-3p 調(diào)控靶基因最多。下調(diào)6 個：miR-145-5p、 miR-133a-3p、 miR-204-5p、 miR-125b-5p、miR-486-5p、miR-512-3p，其中miR-145-5p 調(diào)控靶基因最多。Yue等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-371a-5p過表達后能逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制因子lncRNA TUSC7 對胰腺癌細胞遷移、侵襲和EMT的抑制作用。有研究表明，miR-27a-3p 既具備腫瘤抑制作用[22]也可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[23]。miR-145-5p 是一種腫瘤抑制因子miRNA，在肺癌[24]、膠質(zhì)母細胞瘤[25]等癌癥中表達下調(diào)。miR-7-5p[26]、372-3p[27]、miR-133a-3p[28]、miR-204-5p[29]等也被證明在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。關(guān)于這些核心miRNAs 在PM2.5致HBE 細胞損傷中的分子機制尚不完全清楚，有待后續(xù)研究。

進一步對靶基因之間相互作用分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA、MAPK3、CCR5位于核心位置。VEGFA在血管生成、細胞增殖及遷移等途徑發(fā)揮重要作用，該基因被證明在許多癌癥中表達上調(diào)[30]。MAPK3是哺乳動物中第一個被發(fā)現(xiàn)的絲裂原活化蛋白激酶，是ERK/MAPK 信號途徑中重要組成部分。Cao 等[31]證明miR-129靶向MAPK3調(diào)控胃癌細胞增殖，當MAPK3基因表達抑制時能誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，降低順鉑耐藥性。趨化因子受體是一類介導(dǎo)趨化因子行使功能的GTP-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，已有許多研究表明CCR5 在激活癌癥的生長及轉(zhuǎn)移中具有重要作用[32]。本實驗中這3個蛋白與下調(diào)的miRNAs 靶向相關(guān)，提示VEGFA、MAPK3、CCR5 在PM2.5染毒HBE 后有可能受到調(diào)控而發(fā)生表達改變，可以為下一步PM2.5的致病機制研究提供參考。

綜上所述，本文采用miRNA測序技術(shù)測定了PM2.5染毒HBE 細胞后的差異miRNAs，主要富集在PI3KAkt 信號通路、腫瘤相關(guān)途徑、Ras 信號通路、MAPK信號通路等，篩選了11 個核心miRNAs 和3 個核心基因，并且這些miRNAs 和蛋白與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，為進一步深入研究PM2.5毒性作用機制拓展了新思路。