馬興，張密密，肖亞兵，趙友全

（1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心，天津300461；2.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津300072）

氰化物屬劇毒物質(zhì)，由氰化物引發(fā)的食物中毒、環(huán)境污染[1-4]對突發(fā)公共安全事件管控和處置提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。食品中氰化物主要來源于植物本身所含有的氰甙類物質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道顯示目前已知含有氰甙的植物有至少2 000種，包含木薯、豆類、亞麻籽、甘藍(lán)、苦杏仁和食用菌等[5]。當(dāng)氰甙進(jìn)入人體內(nèi)后，在酸和酶的作用下會(huì)釋放出游離氰，氰離子具有很強(qiáng)的金屬配位能力，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)多種含金屬離子的酶系統(tǒng)，致使如細(xì)胞色素氧化酶、乳酸脫氫酶和過氧化氫酶等酶失活，從而導(dǎo)致中毒現(xiàn)象[6-8]。輕度氰化物中毒有明顯頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、乏力等癥狀，嚴(yán)重者表現(xiàn)為昏迷、肌肉痙攣、嚴(yán)重代謝性酸中毒甚至猝死。

目前，測定食品中氰化物含量的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.36-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氰化物的測定》規(guī)定了氫氰酸與苦味酸鈉的定性顯色方法，分光光度法和氣相色譜法兩種定量檢測方法[9]。其中分光光度法需要先通過水蒸氣蒸餾將氰化物以氫氰酸的形式蒸出，而傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾時(shí)間長、操作復(fù)雜、重現(xiàn)性較差，導(dǎo)致該方法檢測效率較低，對檢測人員的操作技能和檢測經(jīng)驗(yàn)要求較高。氣相色譜法定量爭議較大，目前標(biāo)準(zhǔn)所述操作同樣可以用來檢測硫氰根離子[10-12]，因而實(shí)際檢測過程中難以消除硫氰酸鹽的干擾。

流動(dòng)注射分析法具有自動(dòng)化高，進(jìn)樣量小，試劑消耗量小，環(huán)保性高，檢測量大，穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，最初只用于水質(zhì)氰化物[13]、揮發(fā)酚[14]等項(xiàng)目的檢測。近年來，流動(dòng)注射法在食品和飲料中硫酸鹽[15]、牛奶中青霉素G[16]、木薯中氰化物[17]、海水中痕量錳[18]、蒸餾酒中氰化物[19]、葡萄酒中總糖[20]、生鮮乳中硫氰酸鹽[21]等項(xiàng)目的檢測均取得了較好的結(jié)果。本文使用課題組自主設(shè)計(jì)并制備的快速水蒸氣蒸餾儀提取食品中氰化物，再用流動(dòng)注射儀檢測，將檢測流程由原先的4 h～6 h縮短至30 min以內(nèi)，節(jié)省了人力物力，提高了檢測效率，方法檢出限、準(zhǔn)確度和精密度均滿足實(shí)際檢測要求。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器試劑

1.1.1 儀器

Seal Auto Analyzer 3型連續(xù)流動(dòng)注射儀、XY-2型自動(dòng)進(jìn)樣器：德國Seal公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)：美國密理博公司；ME203型分析天平（感量0.001 g）：瑞士梅特勒-托利多公司；快速水蒸氣蒸餾儀：天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心、天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院合作研發(fā)；UV-2450型分光光度計(jì)：日本島津公司；450-GC型氣相色譜儀：美國布魯克公司。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、乙酸、異煙酸、檸檬酸、硫酸鋅、酚酞、二甲基巴比妥酸、鄰苯二甲酸氫鉀、酒石酸、乙酸鋅、吡唑酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、氯胺T：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

水中氰成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW（E）080115：50.0 μg/mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院。

氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液：1.0 μg/mL，吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用2 g/L氫氧化鈉溶液定容至50 mL。

流動(dòng)注射儀所需試劑按照Seal公司自帶方法配制；分光光度法、氣相色譜法所需試劑按照GB5009.36-2016要求配制。

1.2 流動(dòng)注射儀工作條件

進(jìn)樣速率30個(gè)/h；進(jìn)樣清洗比（時(shí)間）3∶1；蒸餾溫度135℃。

1.3 試驗(yàn)步驟

1.3.1 樣品前處理

將樣品粉碎或勻漿，迅速稱取20g（精確到0.001g）待測樣品置于500 mL反應(yīng)瓶中，加入200 mL去離子水，迅速安裝至快速水蒸氣蒸餾儀，并將冷凝管下端插入盛有10 mL濃度為20 g/mL氫氧化鈉溶液的三角瓶中，室溫（25℃）放置10 min。向反應(yīng)瓶中加入20 mL濃度為100 g/L的乙酸鋅溶液和2 g酒石酸后，迅速將反應(yīng)瓶安裝于快速水蒸氣蒸餾儀，設(shè)定接收液質(zhì)量達(dá)到240 g為蒸餾終點(diǎn)，并啟動(dòng)加熱程序。蒸餾結(jié)束后，將接收液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，定容。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制

分別吸取 0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL 氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL具塞比色管，用2 g/mL氫氧化鈉溶液定容，所配置的氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度分別為0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 μg/mL。分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液5 mL，用流動(dòng)注射儀進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液為橫坐標(biāo)，以峰高為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 快速水蒸氣蒸餾前樣品浸泡時(shí)間的選擇

食品樣品中氰甙并不穩(wěn)定，粉碎或勻漿后需要及時(shí)進(jìn)行前處理。采用快速水蒸氣蒸餾前，樣品需室溫（25℃）中浸泡一段時(shí)間使氰甙水解。試驗(yàn)過程中，選取鮮木薯、苦杏仁原油、亞麻籽粉和烏豆作為目標(biāo)樣品，考察了浸泡時(shí)間對檢測結(jié)果的影響，如表1所示。

表1 不同浸泡時(shí)間下提取氰化物檢測結(jié)果差別Table 1 Difference of cyanide extraction test results under different soaking time mg/kg

對于3種不同類型食品，浸泡時(shí)間分別為10 min、30 min、1 h、2 h，所得檢測結(jié)果均在10%誤差范圍內(nèi)，并無顯著性差別，為提高試驗(yàn)效率，故選擇浸泡時(shí)間為10 min。

2.1.2 水蒸氣蒸餾速度的選擇

快速水蒸氣蒸餾儀可根據(jù)實(shí)際需求選擇蒸氣量，蒸氣量的大小直接決定蒸餾時(shí)間的長短。試驗(yàn)過程中，選取鮮木薯、苦杏仁原油、亞麻籽粉和烏豆作為目標(biāo)樣品，在浸泡時(shí)間均為10 min的條件下，分別選擇高、中、低3種不同大小蒸氣量對待測樣品進(jìn)行氰化物提取，所得結(jié)果無顯著性差異，故選擇較高蒸氣量開展后續(xù)試驗(yàn)，樣品提取時(shí)間約8 min～10 min，具體結(jié)果見表2。

表2 不同蒸氣量下提取氰化物檢測結(jié)果差別Table 2 Differences of cyanide extraction test results under different vapor volumes mg/kg

2.2 線性方程及方法檢出限

用連續(xù)流動(dòng)注射儀對1.3.2中所述氰化物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL），以峰高為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性擬合，得線性方程Y=498 321X+6 852.5，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 6。對空白溶液進(jìn)行6次重復(fù)測定，以測定值3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算方法檢出限，得方法檢出限為0.001 1 mg/L。當(dāng)稱樣量為20 g，定容體積為250 mL時(shí)，待測樣品中氰化物的檢測限為0.014 mg/kg（以氰離子計(jì)）。

2.3 精密度測試

以鮮木薯、苦杏仁原油、亞麻籽粉和烏豆作為目標(biāo)樣品，每個(gè)樣品按照前述方法全流程重復(fù)測定6次，計(jì)算結(jié)果的精密度，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test results

由表3可見，4個(gè)樣品檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 1.9%～5.3%，表明本方法精密度較好。

2.4 加標(biāo)回收測試

以鮮木薯、亞麻籽粉和烏豆作為目標(biāo)樣品，分別加入高、中、低3種不同濃度的氰化物標(biāo)準(zhǔn)中間液，每個(gè)樣品按照前述方法全流程重復(fù)測定6次，計(jì)算每個(gè)樣品的平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery test results

由表4數(shù)據(jù)可以看出，3個(gè)不同濃度的樣品平均加標(biāo)回收率為96.5%～104%，表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度。

2.5 本方法與國標(biāo)方法結(jié)果比對

用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.36-2016檢測方法分別對鮮木薯、苦杏仁原油、亞麻籽粉和烏豆進(jìn)行檢測，所得結(jié)果與本文方法進(jìn)行比對，結(jié)果見表5。

表5 方法比較Table 5 Method comparison

在進(jìn)行苦杏仁原油檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)國標(biāo)第一法顯色步驟產(chǎn)生白色渾濁，無法進(jìn)行正常顯色反應(yīng)。查閱文獻(xiàn)得知[22-23]，苦杏仁原油中氰化物來源于苦杏仁苷，而苦杏仁苷分解后不僅會(huì)產(chǎn)生氫氰酸，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生苯甲醛，苯甲醛同樣會(huì)通過水蒸氣蒸餾的過程進(jìn)入待測液，在顯色反應(yīng)時(shí)與吡唑啉酮產(chǎn)生白色渾濁，從而影響正常顯色反應(yīng)的發(fā)生。本文所述流動(dòng)注射分析采用異煙酸-巴比妥酸作為顯色劑，巴比妥酸不會(huì)與苯甲醛發(fā)生類似反應(yīng)，試驗(yàn)中可正常發(fā)生顯色反應(yīng)，因而檢測結(jié)果不受苯甲醛影響，與氣相色譜法檢測結(jié)果相一致。從表5可以看出，本方法檢測結(jié)果與分光光度法、氣相色譜法結(jié)果具有較好的一致性。

2.6 硫氰酸鹽干擾測試

試驗(yàn)中以亞麻籽粉和烏豆為目標(biāo)樣品，比較了本方法和氣相色譜法抗硫氰酸鹽干擾的情況，結(jié)果見表6。

表6 硫氰酸鹽干擾試驗(yàn)Table 6 Thiocyanate interference test

通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，硫氰酸鹽存在下本方法檢測結(jié)果無明顯變化，說明方法有較好的抗硫氰酸鹽干擾的能力；而當(dāng)硫氰酸鹽存在時(shí)，氣相色譜法檢測結(jié)果明顯偏高，檢測結(jié)果影響較大。分析原因如下：本方法采用水蒸氣蒸餾作為前處理，可將揮發(fā)性較強(qiáng)的氫氰酸蒸出，而硫氰酸揮發(fā)性較弱，留在蒸餾液中，從而將氰離子和硫氰酸根離子分開，去除干擾。氣相色譜法是在頂空瓶中將氰離子在酸性條件下用氯胺T衍生為氯化氰，在相同的條件下，硫氰酸根可發(fā)生相同的衍生化反應(yīng)，從而使檢測結(jié)果普遍偏高。

3 結(jié)論

本文建立了快速水蒸氣蒸餾-流動(dòng)注射分析儀聯(lián)用測定食品中氰化物含量的檢測方法。快速水蒸氣蒸餾儀的使用，能夠有效提高工作效率；流動(dòng)注射分析儀的使用，簡化了試驗(yàn)操作，節(jié)約了人力，提高了試驗(yàn)的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)結(jié)果表明：本方法檢出限、定量限、精密度和準(zhǔn)確度均能夠滿足日常食品檢測需求；采用本方法和國標(biāo)分光光度法、氣相色譜法同時(shí)測定4種不同食品樣品中氰化物的含量，所得結(jié)果數(shù)據(jù)無顯著性差異。與國標(biāo)方法相比，本方法可有效避免樣品基質(zhì)中苯甲醛、硫氰酸鹽等對試驗(yàn)結(jié)果的干擾，方法適用性較廣。本方法全流程檢測時(shí)間僅需約30 min，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性良好，在分析大批量食品樣品時(shí)具有較大優(yōu)勢。