甄振鵬，高裕鋒，李碩聰，龐揚(yáng)海，黃敏興，余構(gòu)彬，郭劍雄

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所），國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316）

低聚木糖是由2個(gè)～7個(gè)木糖分子以β-1，4-糖苷鍵結(jié)合而成的直鏈低聚糖的總稱，主要包括木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖等[1-3]。低聚木糖具有穩(wěn)定性好、熱值低等特性，不易被人體消化酶分解，降低了糖分的有效吸收，避免了食用后血糖明顯上升的現(xiàn)象，是糖尿病或肥胖癥患者極佳的甜味劑[4]。同時(shí)作為超強(qiáng)雙歧因子，低聚木糖的雙歧因子功能是其他低聚糖的10倍以上，可選擇性促進(jìn)人體腸道雙歧桿菌的增殖活性，抑制有害菌生長，改善微生物菌群平衡[5-8]。隨著膳食結(jié)構(gòu)的改善，健康意識的提高，低聚木糖因其優(yōu)越的營養(yǎng)保健功能而備受人們關(guān)注。

酸奶是以牛奶為原料，加入蔗糖，經(jīng)過巴氏殺菌冷卻后，再添加有益菌發(fā)酵培養(yǎng)而成的奶制品。在酸奶發(fā)酵過程中，經(jīng)特定菌種作用，奶中蛋白質(zhì)、糖類等被分解為更小的功能性分子，如氨基酸、乳糖、半乳糖等，同時(shí)降低了脂肪含量，提升了脂肪酸含量，提升了人體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率，因此酸奶在現(xiàn)代膳食結(jié)構(gòu)中占有重要地位。近年來，酸奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，產(chǎn)品類型越來越豐富，功能性酸奶應(yīng)運(yùn)而生。功能性酸奶是指在酸奶中添加一定量的特殊營養(yǎng)成分或功能性成分，如低聚木糖等益生元物質(zhì)，進(jìn)一步提升營養(yǎng)品質(zhì)的一類酸奶[9-12]。目前功能性酸奶在行業(yè)中屬于較前沿的產(chǎn)品，品類不多，因此相對應(yīng)的功能性成分監(jiān)測方法稍有欠缺，尤其是低聚糖方面的檢測方法。多數(shù)情況下，檢測方法的欠缺往往會導(dǎo)致監(jiān)管困難，產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊的現(xiàn)象，因此開發(fā)酸奶中低聚木糖檢測方法，對健全功能性酸奶的質(zhì)量監(jiān)管方法，提高功能性酸奶質(zhì)量監(jiān)控力度具有重要意義。

目前，食品中低聚木糖的檢測方法有薄層層析色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法以及液相色譜法等[13]。薄層層析色譜法一般只作定性檢測[14]；氣相色譜質(zhì)譜法需要衍生化前處理[14]，檢測耗時(shí)長，且不能檢測單一組分；液相色譜法是目前最常用的方法，有直接檢測法、柱前衍生檢測法和硫酸水解間接檢測法等[15-20]。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具備定性準(zhǔn)確、定量靈敏的優(yōu)點(diǎn)，因此利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法開發(fā)食品中低聚糖的檢測方法成為了近年來研究的熱點(diǎn)[21-22]。本文將以功能性酸奶為研究對象，優(yōu)化前處理方法，利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法開發(fā)功能性酸奶中木糖和低聚木糖（木二糖～木六糖）的檢測方法，并在實(shí)際應(yīng)用中對功能性酸奶和普通酸奶進(jìn)行低聚木糖檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-20AD 4000 Q Trap）：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；超純水器（Milli-Q）：美國密理博公司；振蕩器（Multi reax）：德國海道夫公司；電子天平（BSA224S）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖標(biāo)準(zhǔn)品：愛爾蘭Megazyme公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：美國飛世爾公司；有機(jī)相濾膜：廣州太瑋生物科技有限公司。

試驗(yàn)所用的酸奶樣品為市場、網(wǎng)絡(luò)平臺中隨機(jī)購買的樣品，包括功能性酸奶與普通酸奶。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精確稱取木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL容量瓶中，用超純水溶解定容至刻度，將此混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，配成低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Altus UPLC BEH Amide，1.7 μm，2.1 mm×100 mm；流動相A：0.10%氨水溶液，流動相B：乙腈；梯度洗脫：0～1 min20% A；1 min～5 min 20%～40% A；5 min～10 min 40% A；10 min～11 min 40%～20% A；11 min～13min 20% A。流速：0.25 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：ESI-；儀器參數(shù)：氣簾氣壓力241.1 kPa，碰撞氣壓力中檔，離子噴霧電壓4 500 V，離子源溫度550℃，霧化氣壓力378.9 kPa，輔助加熱氣壓力378.9 kPa；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM，具體參數(shù)如表1所示。

表1 測定木糖與低聚木糖的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of xylose and xylo-oligosaccharides

1.4 樣品處理

稱取酸奶樣品1 g（精確至0.01 g）于10 mL比色管中，加入90%乙醇水溶液定容至10 mL，渦旋振蕩，超聲溶解20 min，全部溶液轉(zhuǎn)移于50 mL離心管中，以8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后，取濾液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件選擇

根據(jù)木糖和低聚木糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，比較了C18色譜柱、HILIC色譜柱、普通硅膠基質(zhì)氨基柱和新型雜化顆粒專用氨基柱對木糖與低聚木糖的分離效果。結(jié)果表明，采用1.7 μm填料孔徑新型雜化顆粒技術(shù)專用的氨基柱Altus UPLC BEH Amide，分離效果最好?？紤]木糖與低聚木糖在負(fù)離子噴霧模式下進(jìn)行檢測，加入一定量氨水，能有效提高離子化效率，以乙腈和0.10%氨水溶液作為流動相，調(diào)整流動相比例，在10 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)6種糖的有效分離，如圖1所示。

圖1 木糖與低聚木糖（1.0 mg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖Fig.1 The ion chromatogram of xylose and xylo-oligosaccharides in 1.0 mg/L of standard solution

質(zhì)譜條件優(yōu)化方法：以流動注射直接進(jìn)樣方式下，使用質(zhì)量濃度1.0 mg/L木糖與低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子，子離子確認(rèn)，優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)。

2.2 沉淀溶劑的選擇與優(yōu)化

木糖和低聚木糖易溶于水，可使用超純水作為提取溶劑。但由于酸奶中富含易溶于水的成分，純水提取對檢測造成很大的干擾。特別是酸奶中富含的蛋白質(zhì)大分子會產(chǎn)生乳化和吸附作用，干擾質(zhì)譜檢測，在前處理過程中必須盡量去除。常見的沉淀蛋白質(zhì)的方法有有機(jī)溶劑沉淀法、重金屬鹽沉淀法等[23]。在樣品中分別加入2 mL乙醇、2 mL乙腈、2 mL乙酸鉛溶液，比對試驗(yàn)了不同蛋白沉淀劑，對加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果表明，以乙醇或乙腈作為沉淀劑的效果優(yōu)于乙酸鉛（圖2）。

圖2 不同類別沉淀劑提取溶劑的回收率Fig.2 Recovery of xylose and xylo-oligosaccharides by extraction solvents with different precipitant

綜合考慮溶劑本身的毒性和價(jià)格，確定乙醇作為沉淀劑。進(jìn)一步考察了不同乙醇濃度（0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，90%，100%，體積分?jǐn)?shù)）混合溶劑對加標(biāo)回收率的影響，見圖3。

結(jié)果如圖3所示，使用90%乙醇溶液提取時(shí)對低聚木糖的綜合加標(biāo)回收率最優(yōu)。

圖3 不同乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）提取溶劑的回收率Fig.3 Recovery of xylose and xylo-oligosaccharides by different extraction solvents with different ratio of ethanol/water

2.3 方法線性范圍和檢出限

用 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，以響應(yīng)強(qiáng)度的峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，木糖與低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 5～0.999 7，線性良好。以3倍和10倍信噪比（S/N）確定方法的檢出限和定量限，結(jié)果如表2所示，可以滿足木糖與低聚木糖痕量分析的需要。

表2 木糖與低聚木糖的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Regression equation，liner range，correlation coefficient and detection limit of xylose and xylo-oligosaccharides

2.4 回收率和精密度

準(zhǔn)確添加木糖與低聚木糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白酸奶樣品中，在1.0、2.0、10.0 mg/kg 3個(gè)添加水平下做6次重復(fù)試驗(yàn)，按方法測定，平均添加回收率在76.5%～88.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.8%（見表3），均在允許范圍內(nèi)，符合試驗(yàn)要求。

表3 方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of the method（n=6）

2.5 實(shí)際樣品測試

在市場、網(wǎng)絡(luò)平臺上隨機(jī)購買了30種酸奶，有功能性酸奶與普通酸奶，按照方法進(jìn)行檢測，見表4。

結(jié)果如表4所示，30種酸奶中有10個(gè)樣品檢出木糖，含量為1.35 mg/kg～11.85 mg/kg，但標(biāo)簽并未標(biāo)注加入木糖；20號樣品標(biāo)簽中注明添加了低聚木糖，實(shí)際檢測結(jié)果反映了低聚木糖的實(shí)際添加值，也表明該方法可以用于實(shí)際樣品測試中。

表4 市售酸奶木糖與低聚木糖檢測結(jié)果Table 4 Detection results of xylose and xylo-oligosaccharides in yogurt

3 結(jié)論

通過對前處理方法和色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了酸奶中木糖與低聚木糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法檢出限在0.12 mg/kg～0.54 mg/kg，定量限在0.40mg/kg～1.80mg/kg，回收率在76.5%～88.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.8%，滿足食品檢測分析的要求。該方法簡易、方便、準(zhǔn)確，適用于酸奶中木糖與低聚木糖的定量檢測。