郝麗影，王彥偉，孫玉潔，曹紅梅，黃 甜，逄文強(qiáng)，李向東，鄧均華，田克恭,

(1.洛陽普泰生物技術(shù)有限公司，河南 洛陽 471000；2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471000)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的豬的一種急性、烈性、傳染性疾病。自2018年8月3日我國確診首例發(fā)生于遼寧省沈陽市沈北新區(qū)的疫情以來，ASF迅速在我國各省市蔓延[1-4]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，并嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

ASF尚無有效的疫苗，防控主要依靠嚴(yán)格的生物安全措施。敏感、準(zhǔn)確的診斷試劑可為該病的防控提供可靠的工具。P30、P54、P72、PK205R蛋白均為目前ASFV診斷試劑研究的熱點(diǎn)蛋白[5-10]。其中P30蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，且在病毒感染早期大量表達(dá)和分泌，是優(yōu)良的早期檢測靶標(biāo)[11]。已有研究將P30蛋白應(yīng)用于ASFV抗體的血清學(xué)檢測，但將其單克隆抗體應(yīng)用于膠體金檢測試紙條的研究鮮有報(bào)道[12-15]。為此，利用原核系統(tǒng)表達(dá)重組P30蛋白并制備單克隆抗體，以期建立基于P30蛋白單克隆抗體的膠體金免疫層析檢測法，旨在為ASFV的早期診斷提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因、質(zhì)粒及感受態(tài)細(xì)胞 ASFVP30基因、pET28a質(zhì)粒均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成、提供；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 供試細(xì)胞與病毒 SP2/0細(xì)胞由洛陽普泰生物技術(shù)有限公司保存；豬瘟病毒(SFV)C株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)JXA1-R株、豬偽狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)HH3株均由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.3 供試動(dòng)物 SPF級BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要試劑 ASFV陽性血清、ASFV抗原板、ASFV抗原等均購自歐洲非洲豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室[Centro de Investigación en Sanidad Animal(CISA-INIA), Madrid, Spain]；Ni2+親和層析填料購自美國GE Healthcare公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG、羊抗鼠IgG均購自Thermo公司；HAT混合鹽、HT混合鹽、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等均購自Sigma公司；小鼠單抗Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒購自洛陽佰奧通試驗(yàn)材料中心。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P30的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中ASFVP30基因序列(GenBank: MH766894.1)，進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化后的基因送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全序列合成，5′和3′端分別引入酶切位點(diǎn)NdeⅠ和XhoⅠ，并連接到pET28a質(zhì)粒上。將合成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即為pET28a-P30。

1.2.2 重組P30蛋白的表達(dá) 將pET28a-P30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。取2 mL培養(yǎng)過夜的菌種接種至200 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.8～1.0時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG溶液于28 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。收集菌體，用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，取樣通過SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 重組P30蛋白的純化與Western blot鑒定 在菌體破碎上清液中加入0.01 mol/L咪唑后經(jīng)0.45 μm過濾器過濾。取濾液采用Ni2+親和層析法進(jìn)行純化。收集純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，通過光譜掃描分析目的蛋白的純度，并利用Western blot鑒定其與ASFV陽性血清的反應(yīng)性。

1.2.4 間接ELISA方法的建立 將P30蛋白稀釋至0.1 μg/mL，混勻后加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，于2～8 ℃靜置16～24 h；棄去板中液體，加入封閉液，200 μL/孔，于37 ℃封閉2 h；洗板，加入稀釋后的樣品，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)置加PBS(0.01 mol/L，pH值7.4，下同)的孔為陰性對照，置37 ℃溫育60 min；洗板，加入稀釋至工作濃度的二抗，100 μL/孔，置37 ℃溫育45 min；洗板，依次加顯色劑A、B液，各50 μL/孔，振蕩混勻后置37 ℃避光溫育15 min，加入終止液，50 μL/孔，振蕩混勻。設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450 nm處，測定各孔OD值。陰性對照OD值<0.2時(shí)試驗(yàn)成立，S/N(樣品OD值/陰性對照OD值)≥2.1者，判為陽性；S/N(樣品OD值/陰性對照OD值)<2.1者，判為陰性。

1.2.5 小鼠免疫 按照200 μL/只(含40 μg的重組P30蛋白)的量皮下多點(diǎn)免疫4～6周齡雌性BALB/c小鼠。首次免疫使用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫使用弗氏不完全佐劑。免疫間隔時(shí)間為7 d。于3次免疫后采集小鼠血清，用間接ELISA方法檢測血清抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，于融合前3 d腹腔注射重組P30蛋白80 μg。

1.2.6 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.2.6.1 細(xì)胞融合 無菌分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，將其與1.0×107～1.5×107個(gè)SP2/0細(xì)胞混合后，按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。將融合后的細(xì)胞滴加至鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板，于37 ℃、5% CO2條件下靜置培養(yǎng)。

1.2.6.2 雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆 當(dāng)細(xì)胞長至孔底面積1/2～1/3時(shí)，取上清用1.2.4中所述間接ELISA方法檢測。選擇OD值高的孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。反復(fù)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆，直至單克隆孔的細(xì)胞上清檢測陽性率為100%。

1.2.6.3 單克隆抗體的生產(chǎn)及效價(jià)測定 取BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5 mL/只。10 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，25萬個(gè)細(xì)胞/只。待小鼠腹部明顯膨大后抽取腹水，10 000 r/min離心10 min取上清，系列稀釋后用1.2.4中所述間接ELISA方法檢測，檢測結(jié)果為陽性的孔對應(yīng)的最高稀釋度為腹水的抗體效價(jià)。

1.2.7 單克隆抗體的鑒定

1.2.7.1 亞類鑒定 用小鼠單抗Ig類/亞類/亞型鑒定用ELISA試劑盒對單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定，操作按說明書進(jìn)行。

1.2.7.2 與ASFV的反應(yīng)性鑒定 用ASFV抗原板按照常規(guī)間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)對單克隆抗體進(jìn)行檢測，以加PBS的孔作為陰性對照。

1.2.7.3 特異性鑒定 用豬瘟病毒C株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1-R株、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬圓環(huán)病毒2型HH3株制備的抗原板，分別按照常規(guī)IFA方法對單克隆抗體進(jìn)行檢測，分別設(shè)置加病毒陽性血清、PBS的孔作為陽、陰性對照。

1.2.8 膠體金免疫層析檢測法的建立 用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液，并標(biāo)記純化后的重組P30蛋白單克隆抗體制備膠體金標(biāo)記墊。用另一純化后的P30蛋白單克隆抗體包被檢測線，用羊抗鼠IgG包被對照線，組裝成膠體金檢測試紙條。用試紙條檢測梯度稀釋的ASFV抗原以及陰性樣品，優(yōu)化配對抗體。選擇檢測靈敏度最高且背景清晰的抗體制備膠體金檢測試紙條，再進(jìn)一步對膠體金標(biāo)記抗體制備的pH值、標(biāo)記量、檢測線包被的單克隆抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)工藝。

1.2.9 膠體金免疫層析檢測法的初步評價(jià) 選擇世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的ASFV PCR方法檢測陰性的豬脾、肺、腎、肝、淋巴結(jié)、扁桃體組織研磨液以及血清、抗凝全血共8份樣品作為陰性樣品，并在陰性樣品中按照1∶50比例添加ASFV抗原，制備8份陽性樣品。按照最優(yōu)工藝建立的方法，對樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P30的構(gòu)建

質(zhì)粒雙酶切后電泳檢測，可見約600 bp的目的片段和約5 000 bp的pET28a載體片段(圖1)，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P30構(gòu)建正確。

2.2 重組P30蛋白的表達(dá)

SDS-PAGE鑒定結(jié)果(圖2)表明，菌種在IPTG誘導(dǎo)后可表達(dá)出重組P30蛋白，且表達(dá)的重組蛋白主要存在于上清中，大小約30 ku，與預(yù)期結(jié)果一致。

M:蛋白質(zhì)Marker;1:未誘導(dǎo)全菌;2:誘導(dǎo)后菌體裂解液;3:誘導(dǎo)后菌體裂解液上清

2.3 重組P30蛋白的純化與Western blot鑒定

采用Ni2+親和層析法純化上清中的可溶性重組P30蛋白。SDS-PAGE鑒定及光譜掃描結(jié)果表明,純化后目的蛋白純度約為83%(圖3A)。Western blot結(jié)果顯示，重組P30蛋白與ASFV陽性血清反應(yīng)可見特異性的陽性反應(yīng)條帶(圖3B)。表明重組P30蛋白具有良好的反應(yīng)性。

M:蛋白質(zhì)Marker;1:純化的重組P30蛋白

2.4 P30蛋白免疫小鼠血清ELISA效價(jià)測定

利用P30蛋白免疫5只BALB/c小鼠，3免后小鼠血清的ELISA效價(jià)最高為1∶256 000。

2.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆

將雜交瘤細(xì)胞上清用間接ELISA方法篩選，選擇OD值高的陽性細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，經(jīng)3～5次亞克隆獲得10株穩(wěn)定分泌P30蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4F7、2H4、1B11、1D4、5H3、4A7、4B10、2C8、3C11、2G1。

2.6 P30蛋白單克隆抗體的生產(chǎn)及效價(jià)測定

制備了10株分泌P30蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的小鼠腹水，經(jīng)間接ELISA方法檢測，10株腹水的ELISA效價(jià)均高于1∶40 000。

2.7 P30蛋白單克隆抗體的鑒定

2.7.1 亞類鑒定 10株P(guān)30蛋白單克隆抗體的重鏈亞類為IgG1、IgG2b、IgG2a，輕鏈亞類均為Kappa(表1)。

表1 P30蛋白單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果

2.7.2 與ASFV的反應(yīng)性鑒定 IFA結(jié)果顯示，10株P(guān)30蛋白單克隆抗體與ASFV反應(yīng)后均可見明顯的熒光，而陰性對照無可見熒光。表明10株P(guān)30蛋白單克隆抗體均可與ASFV反應(yīng)(圖4)。

A:單克隆抗體4F7與ASFV的反應(yīng);B:陰性對照

2.7.3 特異性鑒定 IFA結(jié)果顯示，除陽性對照外，P30蛋白單克隆抗體與所有病毒反應(yīng)后均無可見熒光(圖5)，表明所有P30蛋白單克隆抗體與豬瘟病毒C株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒JXA1-R株、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株、豬圓環(huán)病毒2型HH3株均不反應(yīng)，特異性良好。

A:陽性對照;B:陰性對照;C:單克隆抗體4F7

2.8 ASFV膠體金免疫層析檢測法的建立

經(jīng)各項(xiàng)條件優(yōu)化，確定膠體金免疫層析檢測法的最優(yōu)工藝為P30蛋白單克隆抗體1B11按照1.5 mg/mL的量包被，單克隆抗體4F7在pH值8.0、質(zhì)量濃度為18 μg/mL條件下制備膠體金標(biāo)記抗體。該工藝下制備的試紙條檢測ASFV抗原的靈敏度最高，1∶100倍稀釋檢測仍為陽性。

用該方法檢測8份陽性樣品，檢測結(jié)果均為陽性，8份陰性樣品均為陰性，表明該方法可用于ASFV的檢測。

3 結(jié)論與討論

ASF的臨床癥狀與豬瘟等豬常見病易混淆，其診斷需從流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化、病原檢測等方面綜合分析，確診主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果。隨著國內(nèi)ASF疫情的發(fā)展，臨床檢測對診斷方法的需求更加具體化。研制滿足不同應(yīng)用場景需求的多樣化的診斷試劑，將為ASFV病毒疫情的監(jiān)測及控制提供重要的支持。而單克隆抗體的制備，將為其免疫學(xué)診斷試劑的研發(fā)提供重要的生物原料。

P30蛋白由CP204L基因編碼，為ASFV的內(nèi)膜蛋白，是病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。有研究表明，在病毒感染2～4 h即有P30蛋白的表達(dá)，且可持續(xù)整個(gè)感染周期[16-17]。P30蛋白參與病毒內(nèi)化，在病毒入侵宿主細(xì)胞的過程中起重要作用，具有良好的免疫原性，可引起機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體反應(yīng)，于感染后8 d即可檢測到抗體，是一種理想的血清學(xué)診斷和免疫學(xué)檢測抗原[18-22]。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清晰、目的基因表達(dá)量高且表達(dá)周期短，是一種蛋白質(zhì)表達(dá)的重要工具。前人利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ASFV P30蛋白，經(jīng)驗(yàn)證表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)性[18]。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了可溶性的重組P30蛋白，用ASFV陽性血清進(jìn)行Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組蛋白有良好的反應(yīng)原性。用純化的重組P30蛋白免疫小鼠，間接ELISA方法檢測小鼠血清效價(jià)最高為1∶256 000，表明該蛋白有良好的免疫原性。

PETROVAN等[11]的研究表明，P30蛋白單克隆抗體與ASFV有很好的反應(yīng)性，利用IFA方法可以識別病毒，利用免疫組織化學(xué)方法可以檢測感染豬組織中P30蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果均表明，P30蛋白單克隆抗體可作為ASFV檢測的重要工具。本研究制備的10株P(guān)30蛋白單克隆抗體，IFA檢測顯示均可與ASFV反應(yīng)。利用2株P(guān)30蛋白單克隆抗體進(jìn)行了ASFV膠體金免疫層析檢測法的建立，初步評價(jià)可用于ASFV的抗原檢測。以上結(jié)果表明，獲得的P30蛋白單克隆抗體可為ASFV的免疫學(xué)診斷技術(shù)開發(fā)提供重要的生物原料，同時(shí)也可為ASFV P30蛋白的基礎(chǔ)研究提供支持。