方勤美 劉建龍 陳永聰 柯 翎 鄭在予 陳秀霞 龔 暉

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003）

T2 毒素屬于A 型單端孢霉烯族化合物，主要由三線鐮刀、枝孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、梨孢鐮刀菌和硫色鐮刀菌等真菌代謝產(chǎn)生[1]。 食物和飼料中經(jīng)常檢測(cè)真菌毒素，其中T2 毒素最強(qiáng)，是蛋白質(zhì)合成的強(qiáng)抑制劑[2]。 研究證明[3]，T2 毒素可在體內(nèi)產(chǎn)生更強(qiáng)的毒素物質(zhì)，目前沒有有效的治療手段，對(duì)人類食物、動(dòng)物飼料及健康具有潛在危害，唯有預(yù)防監(jiān)測(cè)是唯一有效管控途徑。 所以，建立一套靈敏、快捷的檢測(cè)方法已成為近年來的研究熱點(diǎn)。

目前，已有氣相色譜法[4]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、高效液相色譜法[6]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等用于T2 毒素檢測(cè)， 但這些方法需具備相關(guān)儀器和專業(yè)人員，檢測(cè)成本昂貴，建立一套更簡(jiǎn)便實(shí)用的方法尤為重要。本試驗(yàn)制備單克隆抗體，并建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法， 為食品和動(dòng)物飼料中檢測(cè)T2 奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 T2 毒素免疫原為本室合成并保存。6～8 周齡BALB/c 小鼠購自北京，羊抗鼠的IgG、牛血清白蛋白(BSA)、96 孔板條、PBS 緩沖液購自SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫與細(xì)胞融合 按經(jīng)典程序免疫BALB/c小鼠。選出1 號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)后，45%細(xì)胞培養(yǎng)孔中長(zhǎng)出雜交瘤細(xì)胞株， 用間接非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 篩選，并用間接競(jìng)爭(zhēng)法確證，從中選擇出一株效價(jià)高又能被T2 毒素強(qiáng)抑制的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3 次克隆化后，克隆陽性率達(dá)100%，將其凍存于液氮罐中。

1.2.2 T2-OVA 板孔的制備 將T2-OVA 用CBS緩沖液稀釋至0.06 ug/mL，充分混勻后，在96 孔板的每孔中加入50 uL，37 ℃溫育2 h， 用PBST 洗板4 次，每次間隔3 min；拍干后加滿封閉液，4 ℃封閉過夜，洗板；晾干后將板條密封置于冰箱保存，備用。

1.2.3 抗體效價(jià)測(cè)定 采用間接ELISA 測(cè)定小鼠的血清效價(jià)。 取經(jīng)包被好的T2-OVA 板孔，每孔中加入50 uL 無菌PBS，然后自第一排依次加入50 uL小鼠血清，倍比稀釋至倒數(shù)第2 排，最后1 排為空白對(duì)照，37 ℃孵育20 min， 用洗液洗板3 次； 每孔加50 uL 羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育20 min，用洗液洗板5 次；每孔加50 uL 顯色液，室溫振蕩反應(yīng)10 min；每孔加入50 uL 終止液，用酶標(biāo)儀讀取OD450值。

1.2.4 抗體對(duì)T2 毒素半數(shù)抑制濃度（IC50） 的測(cè)定采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 鑒定單克隆抗體對(duì)T2 毒素半數(shù)抑制濃度（IC50）。 具體操作如下：加不同濃度的T2毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 uL 作為抑制劑；加T2 毒素單克隆抗體50 uL， 反應(yīng)20 min， 用洗液洗板3 次；每孔加50 uL 羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育20 min，用洗液洗板5 次；每孔加50 uL 顯色液，室溫振蕩反應(yīng)10 min； 每孔加入50 uL 終止液， 用酶標(biāo)儀讀取OD450值。1.2.5 T2 毒素檢測(cè)試劑盒的制備 試劑盒方法采用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原， 板孔底部包被羊抗鼠的IgG （二抗），利用T2 毒素的單克隆抗體既可以與底部包被二抗結(jié)合又可與自身抗原（T2 毒素）結(jié)合的特點(diǎn)，將其固定在板孔底部的同時(shí)， 使標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)物與酶標(biāo)抗原與其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。洗去游離的物質(zhì)后，固相上的酶量與標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)物為一定的比例關(guān)系， 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與酶量呈正相關(guān)， 與標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)物的量呈負(fù)相關(guān)，故可根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

2 結(jié)果與討論

制備的腹水效價(jià)為1:1.024×106，純化后的抗體效價(jià)為1:5.76×105。 抗體活性保持良好。

2.1 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：待測(cè)孔OD450值/空白孔OD450值≥2.1，判定該抗體效價(jià)為1:5.76×105。 表1 結(jié)果顯示，抗體效價(jià)達(dá)到1:36 000。

2.2 篩選合適的單克隆抗體 計(jì)算出抑制率B/B0的值（B0為不加T2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的吸光值，B 為加不同質(zhì)量濃度T2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值），以B/B0的結(jié)果為縱坐標(biāo)，以T2 毒素質(zhì)量濃度（ng/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)， 繪制T2 毒素對(duì)小鼠多抗血清的抑制曲線，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出回歸方程，計(jì)算出小鼠多抗血清對(duì)T2 毒素的半數(shù)抑制濃度(IC50)為2.0 ng/mL，見圖1、表2-表3。

圖1 T2 毒素半數(shù)抑制濃度（IC50）測(cè)定抑制曲線

經(jīng)綜合分析， 選擇酶標(biāo)抗原稀釋12 000 倍、抗體稀釋2 000 倍的組合為宜。

2.3 抗體對(duì)T2 毒素半數(shù)抑制濃度（IC50）的測(cè)定 從表4 結(jié)果可知， 抗體對(duì)T2 毒素半數(shù)抑制濃度（IC50）為8.96 ng/mL。

表1 抗體效價(jià)測(cè)定

表2 小鼠多抗血清對(duì)T2 毒素半數(shù)抑制濃度(IC50)的測(cè)定

表3 單克隆抗體與酶標(biāo)記物配比測(cè)定

表4 抗體對(duì)T2 毒素半數(shù)抑制濃度（IC50）的測(cè)定

2.4 用試劑盒進(jìn)行測(cè)試 從表5 結(jié)果可知，該試劑盒的靈敏度和回歸率效果都很好， 試劑盒可用于大量樣本的測(cè)評(píng)。

表5 試劑盒測(cè)評(píng)