賈程豪 高天翔 徐勝勇 宋 娜①

(1. 中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266003； 2. 浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 舟山 316022)

菖 鲉 屬 (Sebastiscus) 隸 屬 于 輻 鰭 魚 綱(Actinopterygii)、新鰭魚亞綱(Neopterygii)、鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉亞目(Scorpaenoidei)、鲉科(Scorpaenidae)， 主要分布于西太平洋以及印度尼西亞海域地區(qū)(Gloerfeltet al， 1984)。菖鲉屬魚類曾被劃分為平鲉屬(Sebastes)的一部分， 直到 1904 年Jordan 和Starks 根據(jù)魚鰾的發(fā)達(dá)程度以及第二眶下骨的不同對其鑒別， 從而將其作為一個(gè)獨(dú)立的屬(Jordanet al， 1904； Matsubara， 1943a， b)。也曾經(jīng)有學(xué)者想要把菖鲉屬作為平鲉屬的亞屬進(jìn)行分類的報(bào)道(Barsukovet al， 1978)， 但目前多數(shù)文獻(xiàn)都將菖鲉屬作 為 一 個(gè) 獨(dú) 立 的 有 效 屬(Amaoka， 1984； Shimizu， 1984a， b； Washingtonet al， 1984)。

目前菖鲉屬被認(rèn)為存在四個(gè)物種， 分別是： 白斑菖鲉(Sebastiscus albofasciatus)、褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)、三色菖鲉(Sebastiscus tertius) (Lacepède， 1802； Cuvieret al， 1829； Barsukovet al， 1978)以及日本學(xué)者 2018 年報(bào)道的一個(gè)菖鲉屬新種(Sebastiscus vibrantus) (Morishitaet al， 2018)。其中， 褐菖鲉廣泛分布于西北太平洋， 其他種類都主要分布于東亞和印度尼西亞的溫暖水域(成慶泰等， 1962； 朱元鼎等， 1963； 成慶泰， 1997； Nakaboet al， 2013； Morishitaet al， 2018)。

三色菖鲉(Sebastiscus tertius)， 俗稱三色石狗公， 是菖鲉屬中體型較大的種類， 最大可長到30cm 以上(陳大剛等， 2015； Morishitaet al， 2018)。該物種主要分布于朝鮮半島、日本、中國臺灣以及印度尼西亞東部海域(Nakaboet al， 2013)。目前， 關(guān)于三色菖鲉的研究報(bào)道較少， 僅見國外關(guān)于該物種形態(tài)學(xué)以及對其溫度光照脅迫影響的研究(Tokimuraet al， 2001； Baeket al， 2004； Limet al， 2014)。在我國， 到目前為止所記錄到的三色菖鲉均來自臺灣地區(qū) (邵廣昭等， 1993)， 香港地區(qū)雖有存在該物種的報(bào)道， 但并未有照片和標(biāo)本為佐證(Yvonneet al， 2000)， 而中國大陸其他地區(qū)則沒有記錄(成慶泰等， 1962； 朱元鼎等， 1963； 金鑫波， 1985； 成慶泰， 1997； 李金平等， 1999； 徐學(xué)軍， 2001； 鄧思明等， 2006； 劉敏等， 2013)。

DNA 條形碼(DNA barcoding)由Hebert 等(2003a)提出， 是一種對一段或多段目標(biāo)基因進(jìn)行分析以識別物種的分子鑒定技術(shù)。微型DNA 條形碼是指長度明顯小于600bp 的一段序列(程鵬等， 2012)， 由于部分樣品在保存過程中其DNA 發(fā)生了降解， 很難得到完整的DNA 條形碼， 相比而言， 200bp 左右的序列更易擴(kuò)增， 進(jìn)而進(jìn)行物種鑒定， Cywinska 等(2006)通過應(yīng)用該技術(shù)對蛾類物種進(jìn)行研究， 結(jié)果表明通過選取特定的200bp 左右長度的序列可以有效對物種進(jìn)行鑒定。當(dāng)前DNA 條形碼和微型DNA 條形碼已被廣泛運(yùn)用于新物種和新記錄種的發(fā)現(xiàn)以及對物種的鑒定等研究當(dāng)中(彭居俐等， 2009； 程鵬等， 2012； Cywinskaet al， 2006； Gaoet al， 2011； Qinet al， 2013； Fanget al， 2015)。本研究記錄了從浙江舟山海域采集的三色菖 鲉， 在對其形態(tài)特征進(jìn)行描述的同時(shí)還測定了該物種的COI 基因片段序列以及12S rRNA基因片段短序列， 并與GenBank 中的相關(guān)同源序列進(jìn)行了比較分析， 為中國菖鲉屬魚類的分類提供理論依據(jù)， 同時(shí)為中國大陸近海菖鲉屬魚類研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三色菖 鲉標(biāo)本于2018 年4 月20 日采自浙江省舟山市近海(坐標(biāo)： 30.0607°N， 122.3546°E)， 共19 尾， 體長167.1—254.3mm。標(biāo)本保存于中國海洋大學(xué)漁業(yè)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(OUC-FEL)， 標(biāo)本編號： OUC_FEL 20180401—20180419。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)研究 本研究采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)測量方法， 用直尺直接測量樣品的全長、體長， 精度精確至 0.1mm； 用游標(biāo)卡尺測量樣品的測量性狀， 精度精確至 0.01mm， 在本研究中， 具體測量性狀包括： 體寬、體高、頭長、吻長、尾柄長、尾柄高、上頜長、眼徑、眼間距、眼后頭長、胸鰭長、腹鰭長、背鰭基長、臀鰭基長； 用電子天平測量樣品體質(zhì)量， 精確至0.01g。對樣品的計(jì)數(shù)性狀進(jìn)行直接計(jì)數(shù)， 計(jì)數(shù)性狀包括： 背鰭數(shù)、胸鰭數(shù)、腹鰭數(shù)、臀鰭數(shù)、尾鰭數(shù)、鰓耙數(shù)、鰓弓數(shù)、脊椎骨數(shù)。

三色菖鲉的可量性狀及其測度依據(jù)見圖1。其中， 上頜長(UJL)和眼間距(ID)以實(shí)際測度數(shù)據(jù)為依據(jù)， 未在圖中標(biāo)注。

圖1 三色菖鲉可量性狀特征 Fig.1 The schematic diagram of morphologic measurement of S. tertius

1.2.2 遺傳學(xué)研究 取19 尾所得樣品尾部的適量肌肉組織， 采用酚-氯仿方法提取肌肉中的DNA， 并在將所提取DNA 溶解后置于4°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴(kuò)增樣品線粒體DNA 12S rRNA 片段的引物為MiFish-U-F 和MiFish-U-R (Miyaet al， 2015)， 引物序列為： MiFish-U-F： 5′-TTTGTCGGTAAAACT CGTGCCAGC-3′， MiFish-U-R： 5′-CAAACTGGGAT TAGATACCCCACTAT AA-3′。用于擴(kuò)增樣品線粒體DNA COI 片段的引物為FishF1 和FishR1 (Wardet al， 2005)， 引 物 序 列 為： FishF1： 5′-TCAACCAACCAC AAA GACATTGGCAC-3′， FishR1： 5′-TAGACTTC TGGGTGGCCAAAGAATCA-3′。

PCR 反應(yīng)體系為25μL， 包括0.25μL 的0.15μL的EasyTaq 酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)， 各反應(yīng)體系組分參照俞正森等(2017)研究中所用PCR 反應(yīng)體系。PCR 擴(kuò)增所需反應(yīng)條件參照Fang 等(2015)研究中所用反應(yīng)條件。所用PCR 儀為TaKaRa PCR Thermal Cycler MP (TP3000)。以上反應(yīng)均設(shè)陰性對照以排除產(chǎn)生引物二聚體以及DNA 污染的情況。在進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(U=5V/cm)進(jìn)行確認(rèn)之后， 將所得PCR 產(chǎn)物送至青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

將測得的12S rRNA 以及COI 基因片段序列用DNAStar(USA)軟件包中的SeqMan 軟件進(jìn)行人工校正和序列比對。從GenBank 中下載所有拉丁學(xué)名為Sebastiscus tertius的同源序列以及部分拉丁學(xué)名為Sebastiscus marmoratus的同源序列(表1， 表2)進(jìn)行分析， 使用MEGA5.0 鲉軟件以平 科魚類的同源序列(表1， 表2)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 并計(jì)算組群間和組群內(nèi)的遺傳距離。

表1 本研究所用12S rRNA 序列信息(*表示信息缺失) Tab.1 Information of the 12S rRNA sequences cited in this study (*： data missing)

表2 本研究所用COI 序列信息 Tab.2 Information of the COI sequences cited in this study

2 結(jié)果

2.1 三色菖鲉 Sebastiscus tertius (Barsukov and Chen, 1978)形態(tài)特征(圖2)

基本體型和體色見圖2。所用19 尾標(biāo)本魚體呈長橢圓形(側(cè)面觀)， 體色呈紅色到淡粉色。所得標(biāo)本均身披櫛鱗。頭大， 頭部棘棱顯著， 眼上側(cè)位?？羟肮窍潞蠼怯? 枚棘。前鰓蓋骨有5 枚棘， 鰓蓋骨有2 枚棘。胸鰭較為寬大， 且胸鰭基底中部有一較大暗斑。

三色菖 鲉的可數(shù)性狀見表3。其中， 背鰭數(shù)、腹鰭數(shù)、腹鰭數(shù)、臀鰭數(shù)、鰓弓數(shù)和脊椎骨數(shù)均為定值； 胸鰭鰭條數(shù)范圍為18—19， 大部分為19(71%)； 尾鰭鰭條數(shù)范圍為 13—17， 大部分為 16(46%)； 上鰓耙數(shù)范圍為6—7， 下鰓耙數(shù)范圍為13—17， 其中上鰓耙數(shù)為7， 下鰓耙數(shù)為16 的個(gè)體較多(25%)。

圖2 三色菖鲉(OUC_FEL 180404)， 254.3mm SL， 采自舟山近海 Fig.2 S. tertius (OUC_FEL 180404)， 254.3mm SL， collected from coastal waters of Zhoushan

表3 舟山近海的三色菖鲉標(biāo)本的可數(shù)性狀及菖鲉屬魚類可數(shù)性狀參考數(shù)值(＊表示信息缺失) Tab.3 Countable characters of S. tertius specimens from Zhoushan coastal waters and the reference value for Sebastiscus fish (*： data missing)

可量性狀比見表 4。其中， 全長為體長的1.2—1.3 倍， 體長為體高的2.7—3.4 倍， 為頭長的2.4—2.8 倍， 為眼后頭長的4.0—5.5 倍。頭長為眼徑的3.7—5.5 倍， 為眼間距的4.8—8.5 倍， 為上頜長的4.5—6.4 倍。體長為尾柄長的5.4—7.1 倍， 尾柄長為尾柄高的1.5—2.1 倍。

表4 舟山近海的三色菖鲉標(biāo)本的可量性狀比 Tab.4 Ratios between measurable characters of S. tertius from Zhoushan

2.2 DNA 條形碼分析

2.2.1 12S rRNA 基因片段分析 對所得標(biāo)本中的19 尾三色菖鲉的12S rRNA 基因片段進(jìn)行雙向測序后， 共獲得 19 條長度為 168bp 的序列， 其GenBank 號為MN854386—MN854404。將本研究所得序列與GenBank 中學(xué)名為Sebastiscus tertius以及5條與三色菖 鲉同屬的學(xué)名為Sebastiscus marmoratus的同源序列(表1)進(jìn)行比較， 采用鄰接法以湯氏平 鲉和許氏平 鲉為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 結(jié)果表明， 在該系統(tǒng)樹上明顯分為兩個(gè)組群(圖3)。其中， GenBank 中序列號為LC026726 和AB969892 的學(xué)名為Sebastiscus tertius的2 條序列與本研究的19尾三色菖 鲉的12S rRNA 序列先聚類， 該組內(nèi)平均遺傳距離為0.000， 而GenBank 中的學(xué)名為Sebastiscus marmoratus的5 條序列聚為一支， 該組內(nèi)平均遺傳距離為0.002 (0.000—0.006)， 兩組群間的遺傳距離為0.026。

2.2.2 COI 基因片段序列分析 對所得標(biāo)本中的19 尾三色菖鲉的COI 基因片段進(jìn)行雙向測序， 共獲得 19 條長度為652bp 的序列， 其GenBank 號為MN863509—MN863527。將本研究所得序列與GenBank 中學(xué)名為Sebastiscus tertius以及5 條與三色菖鲉同屬的學(xué)名為Sebastiscus marmoratus的同源序列(表2)進(jìn)行比較， 采用鄰接法以朝鮮平鲉和許氏平鲉為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 結(jié)果表明， 在該系統(tǒng)樹上明顯分為兩個(gè)組群(圖4)。其中， GenBank 中序列號為KM366112 和KU943360 的學(xué)名為Sebastiscus tertius的2 條序列與學(xué)名為Sebastiscus marmoratus的5 條序列先聚類， 該組內(nèi)的平均遺傳距離為0.002 (0.000—0.004)， 而本研究的19 尾三色菖鲉聚為一支， 該組內(nèi)的平均遺傳距離為0.002 (0.000—0.011)， 兩組群間的遺傳距離為0.044。

3 討論

浙江海域原有記錄的菖鲉屬魚類僅1 種， 即褐菖鲉(吳常文， 1999； 趙盛龍等， 2006； 俞存根等， 2010)。中國大陸近海海域原有記錄的菖鲉屬有2 種， 分別是褐菖鲉和白斑菖鲉(金鑫波， 1987)。本次研究所發(fā)現(xiàn)的三色菖鲉為浙江省海域記錄的第2 種菖鲉屬魚類， 也是我國除臺灣海域外所記錄到的第3 種菖鲉屬魚類。本研究通過對舟山海域獲得的三色菖鲉標(biāo)本分別進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)上的鑒定， 為中國近海海域菖鲉屬魚類的鑒定提供依據(jù)。

三色菖鲉的原記錄分布范圍為朝鮮半島、日本、臺灣以及印度尼西亞東部的海域(Nakaboet al， 2013)， 于我國原本只記錄于臺灣海域(邵廣昭等， 1993)， 在我國大陸近海尚未有所記載。本研究所得樣品增補(bǔ)了該物種的分布記錄， 從我國近海范圍來看， 本研究將其分布范圍從我國臺灣海域擴(kuò)大到東海北部的舟山海域； 從世界范圍來看， 本研究填補(bǔ)了北方朝鮮半島、日本海域的已有分布記錄與南方臺灣、印度尼西亞東部海域的已有分布記錄之間的空白海域， 完善了三色菖鲉的世界分布范圍記錄。

圖3 基于12S rRNA 序列， 以湯氏平鲉和許氏平鲉為外群運(yùn)用鄰接法構(gòu)建的三色菖鲉系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree of Sebastiscus tertius using Sebastes thompsoni and Sebastes schlegelii as outgroups based on neighbor-joining method and 12S rRNA sequences

在菖鲉屬魚類中， 三色菖鲉與褐菖鲉形態(tài)非常相似。有學(xué)者將三色菖鲉認(rèn)為是生活在深層海域的褐菖鲉(Matsubara， 1943a)。在褐菖鲉與三色菖鲉的比較研究中， 沒有單獨(dú)的形態(tài)特征可以較為明顯的區(qū)分兩個(gè)物種， 只能通過多種性狀的結(jié)合如胸鰭鰭條數(shù)的數(shù)量、鰓耙的數(shù)量和魚體的顏色來進(jìn)行識別(Barsukovet al， 1978)。在Barsukov 等(1978)的研究中， 褐菖鲉和三色菖鲉之間最大的不同體現(xiàn)為胸鰭鰭條的數(shù)量： 大多數(shù)(80.7%)的褐菖鲉有18 個(gè)， 變動(dòng)范圍在17—19 之間； 大多數(shù)(83%)的三色菖鲉有19個(gè)， 變動(dòng)范圍在18—20 之間。在本研究中， 所得標(biāo)本的胸鰭鰭條數(shù)的數(shù)量為 18—19 之間， 且大部分(71%)為19。Barsukov 等(1978)還發(fā)現(xiàn)， 就體色而言， 三色菖鲉的體色是棕紅色到粉色之間并帶有小斑點(diǎn)， 比褐菖鲉的體色更加鮮艷。本研究所采集到的標(biāo)本的體色均與該描述相符合。此外， 有研究表明， 三色菖鲉的體型可以成長到比褐菖鲉大(Tokimuraet al， 2001)， 且三色菖鲉所生活的水層比褐菖鲉更深(Amaoka， 1984； Shimizu， 1984a， b)。

圖4 基于COI 序列， 以朝鮮平 鲉 和許氏平 鲉 為外群運(yùn)用鄰接法構(gòu)建的三色菖 鲉系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.4 Phylogenetic tree of Sebastiscus tertius using Sebastes koreanus and Sebastes schlegelii as outgroups based on neighbor-joining method and COI sequences

線粒體12S rRNA 基因序列具有相對保守的進(jìn)化速率， 可以很好地區(qū)分種間和屬間的親緣關(guān)系， 并已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于魚類等脊椎動(dòng)物的分子系統(tǒng)學(xué)等研究(唐優(yōu)良等， 2011)。Miya 等(2015)通過對比大量物種線粒體DNA 的12S rRNA 基因序列， 找到了 其中的一個(gè)高變區(qū)片段(163—185bp)， 并設(shè)計(jì)了相關(guān)引物， 以此對魚類的科、屬、種進(jìn)行了鑒定。Wang等(2020)也通過使用該序列片段， 從所得1357 個(gè)個(gè)體中準(zhǔn)確鑒別出 37 個(gè)物種。本研究所得三色菖鲉12S rRNA 序列與GenBank 中已有的褐菖鲉序列明顯分為兩個(gè)組群， 其同屬內(nèi)的種間遺傳距離為0.026， 高于種內(nèi)遺傳變異的物種劃界閾值(≥0.02) (Hebertet al， 2004)， 且與GenBank 中已有的三色菖鲉序列(序列號為LC026726 和AB969892)完全一致， 可作為三色菖鲉的微型DNA 條形碼。

Hebert 等(2003b)通過對大量物種的線粒體COI基因序列進(jìn)行分析， 表明COI 基因序列能夠很好地區(qū)分動(dòng)物物種， 是適合用來對物種進(jìn)行鑒定的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因。本研究所得三色菖鲉COI 序列與GenBank 中已有的三色菖鲉序列(序列號為KM366112 和KU943360)通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹明顯分為兩個(gè)組群， 且網(wǎng)上已有的三色菖 鲉序列與GenBank 已有的褐菖鲉序列聚為一支， 其同屬內(nèi)的種間遺傳距離為0.044， 超過了種內(nèi)平均遺傳變異的物種劃界閾值(≥0.02) (Hebertet al， 2004)， 推測這兩條序列所對應(yīng)的樣品可能為褐菖鲉而非三色菖鲉。

4 結(jié)論

本文報(bào)道了浙江舟山海域一新紀(jì)錄種： 三色菖鲉， 并描述其形態(tài)以及研究其DNA 條形碼， 表明在鑒定形態(tài)極其相似的物種時(shí)對其DNA 條形碼研究的必要性。三色菖鲉學(xué)名為Sebastiscus tertius(Barsukov and Chen， 1978)， 其廣泛分布于西太平洋， 在我國分布于東海、南海以及臺灣海域。本研究結(jié)果對于中國菖鲉屬魚類的分類具有積極的參考作用， 同時(shí)為中 國近海菖鲉屬魚類研究提供基礎(chǔ)資料。此外， 如果三色菖鲉為近幾年來才進(jìn)入舟山近海海域的物種， 其出現(xiàn)可能會(huì)對舟山當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響， 進(jìn)一步的生物學(xué)和遺傳學(xué)研究有助于更好地了解該物種的種群歷史和該物種的分布范圍變化。