潘丹峰 蒼玉珍 沈峰 林寒瀟

【關(guān)鍵詞】健脾法;腸內(nèi)營養(yǎng);潰瘍性結(jié)腸炎;腸道菌群

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是結(jié)腸黏膜的一種特發(fā)性炎癥性疾病，通常由直腸以連續(xù)的方式向近端延伸至部分或整個結(jié)腸，主要臨床表現(xiàn)有腹痛、腹瀉和便血等[1]。UC患者中營養(yǎng)不良和特定的營養(yǎng)素缺乏很常見，因此在治療UC過程中藥物和營養(yǎng)的結(jié)合可以進一步緩解疾病[2]。大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)，給予UC患者腸內(nèi)營養(yǎng)（EN）治療不僅能夠改善患者的營養(yǎng)狀況，而且還可以通過減少炎性因子的釋放和影響胃腸道菌群構(gòu)成等途徑減輕UC的炎癥反應(yīng)[3]。但有研究發(fā)現(xiàn)部分患者在應(yīng)用EN治療之后耐受性欠佳，部分出現(xiàn)腹脹、腹瀉等不良反應(yīng)[2]。單純的EN處理可能對于UC的治療存在一定的局限性，因此有必要對EN進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整、改良。

中醫(yī)治療中“脾胃為后天之本、氣血生化之源”的理論，與現(xiàn)代EN治療原則是類似的，有研究發(fā)現(xiàn)部分健脾中醫(yī)藥方可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群來緩解UC的癥狀，因此可以在傳統(tǒng)中藥方中探索能改善EN治療UC的方法[4-5]。健脾方是以四君子湯為基礎(chǔ)的經(jīng)典傳統(tǒng)中草藥配方，其藥物組成為黨參、白術(shù)、云苓、甘草，被廣泛用于改善胃腸道疾病[6]。在本研究中，我們探索健脾法聯(lián)合EN對葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的UC大鼠的腸黏膜保護作用，并通過對大鼠糞便的腸道菌群進行測序分析，探討其對腸道菌群的影響。

材料與方法

一、健脾方的成分與制備

健脾方的四種草藥均為本院中藥房提供。對各成分進行準(zhǔn)確稱重之后，先在蒸餾水中浸泡30min，然后使用加熱回流法提取2次（第1次1h，第2次45min）。在減壓和恒定體積下將提取物蒸發(fā)至相當(dāng)于1g/ml的粗藥，濾過，放涼后待用，見表1。

二、實驗動物與造模

60只SD大鼠，4周齡，體質(zhì)量120～150g。實驗過程中，大鼠在清潔級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲用滅菌用水。采用DSS法構(gòu)建大鼠UC模型，配置5%（w/v）的DSS溶液供給大鼠自由飲用，7d后誘發(fā)急性腸炎。

三、動物的分組與給藥

UC模型建立完成后，將60只大鼠按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、EN組、健脾組、EN聯(lián)合健脾（EN+健脾）組，每組12只，雌雄各半。除空白組外，其余各組均采用DSS法復(fù)制UC模型?？瞻捉M自由飲食、飲水;模型組的大鼠予少渣飲食，自由飲水，2組均每天通過灌胃法予生理鹽水25ml/kg（分3次）。健脾組的大鼠在少渣飲食基礎(chǔ)上給予健脾方，健脾方成人的每日劑量約為3.3g/kg，大鼠與人體間的等效劑量的換算系數(shù)為6.17，故設(shè)置大鼠的健脾方劑量為每日0.54g/kg，分3次灌胃[7]。EN組使用全安素配方粉（美國雅培制藥公司）配制成4.18kJ/ml的混懸液，即用23.25g營養(yǎng)粉加滅菌注射用水配成100ml營養(yǎng)液（每100ml含蛋白質(zhì)3.7g、碳水化物13.3g、脂肪3.3g，能量418kJ），喂養(yǎng)劑量參考之前的動物研究，設(shè)置大鼠每日用量為160ml/kg，分3次灌胃[8]。EN+健脾組將健脾方加入營養(yǎng)液中，通過灌胃法分3次給予。各組均連續(xù)喂養(yǎng)14d。本實驗符合動物實驗相關(guān)倫理規(guī)范。

四、疾病活動指數(shù)（DAI）評分

DAI常用于評估大鼠UC的嚴重程度。在實驗期間觀察和記錄大鼠在整個實驗過程中的一般狀況，并根據(jù)糞便性狀、便血和體質(zhì)量降低程度評分：①糞便性狀（0分，正常;1分，松散;2分，黏液便;3分，稀爛便）;②便血（0分，潛血試驗陰性;2分，陽性;4分，肉眼可見）;③體質(zhì)量減輕的百分比（0分，無體質(zhì)量減輕;1分，1%～5%;2分，5%<百分比<10%;3分，10%～15%;4分，>15%）。DAI評分為上述3個參數(shù)之和[5]。

五、結(jié)腸長度測量及病理學(xué)檢查

結(jié)腸長度是反映結(jié)腸直腸炎癥嚴重程度的一個重要指標(biāo)。處死大鼠后快速摘取盲腸及整段結(jié)腸，使用尺子測量、記錄結(jié)腸的長度。并將遠端結(jié)腸及回盲部組織切成小塊，制作成病理切片之后，送病理科，由專業(yè)技術(shù)人員按照Cooper的方法對結(jié)腸炎癥浸潤和杯狀細胞缺失情況進行組織學(xué)損傷（HI）評分[9]。

六、糞便樣本的采集及菌群16S測序

在處死大鼠的時候，立即采集各組大鼠盲腸末端的糞便樣品放于EP管中，避免外界污染，將糞便樣品置于-80℃冰箱中保存。首先使用DNeasyPowerSoil試劑盒（QIAGEN）提取各組大鼠糞便的總基因組DNA，并用NanoDrop分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量。由北京基諾來普生物科技有限公司提供腸道菌群的引物，使用Illuminamiseq平臺對合格的樣品進行測序。將相似度>97%的序列歸類為同一操作分類單元（OUT），使用QIIME軟件（v1.80）執(zhí)行α多樣性分析，計算Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)，統(tǒng)計門水平和科水平OUT聚類情況，進行相對豐度的分析。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0進行分析。使用Shapiro-Wilk法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，各組與模型組和EN組之間的兩兩比較采用LSD-t檢驗;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，各組之間的兩兩比較采用Bonferroni法（α'=0.05/10）。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，α=0.05。

結(jié)果

一、對UC大鼠體質(zhì)量和DAI的影響

連續(xù)7d在飲用水中添加5%DSS，誘發(fā)大鼠產(chǎn)生UC。在建模過程中，大鼠出現(xiàn)嚴重腹瀉、糞便隱血、體質(zhì)量下降等與人UC類似的癥狀。在第21日，各實驗組大鼠體質(zhì)量變化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.741，P<0.001）。與空白組（120.1%±11.2%）相比，DSS處理組（74.4%±9.6%）體質(zhì)量下降（P<0.001）。但是與模型組相比，EN組（92.0%±7.6%，P=0.010）和EN+健脾組（105.3%±11.5%，P=0.003）的大鼠體質(zhì)量下降程度較小;同時與EN組相比，EN+健脾組中的大鼠體質(zhì)量下降程度降低（P=0.033），見圖1。

秩和檢驗發(fā)現(xiàn)，各組的DAI評分差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（H=20.204，P<0.001）。與空白對照相比，DSS處理的大鼠DAI評分高[2.0（1.8，2.8）分，P=0.006]。EN組[1.2（1.0，1.8）分，P<0.05/10]和EN+健脾組[0.5（0，1.2）分，P<0.05/10]的DAI評分低于模型組，而健脾組的DAI評分[1.5（1.0，2.5）分]和模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.522）。另外，EN+健脾組大鼠的DAI評分低于EN組（P<0.05/10），見圖2。

二、對結(jié)腸長度及HI評分的影響

實驗結(jié)束時，各組大鼠結(jié)腸長度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.206，P<0.001）。與空白組的（9.69±1.41）cm相比，模型組的大鼠結(jié)腸長度為（5.93±1.17）cm，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。EN[（7.71±1.10）cm，P=0.022]和EN+健脾組（8.47±1.33cm，P<0.001）大鼠的結(jié)腸均長于模型組。健脾組大鼠結(jié)腸長度[（6.08±1.12）cm]與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.754）。另外EN+健脾組大鼠的結(jié)腸長度也長于EN組，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），見圖3。

各組的HI評分存在統(tǒng)計學(xué)差異（F=8.338，P<0.001）。模型組大鼠的結(jié)腸組織發(fā)生了黏膜病變、壞死以及單核細胞和中性粒細胞等炎性細胞浸潤，HI評分高于空白組（P<0.001）。EN處理表現(xiàn)出明顯的保護作用，組織炎癥程度較輕（P=0.022），而健脾組未發(fā)現(xiàn)對炎癥有保護作用（P=0.870）。EN+健脾組大鼠的HI評分低于EN組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.012），見圖4。

三、對大鼠腸道菌群多樣性的影響

各實驗組大鼠腸道菌群多樣性存在統(tǒng)計學(xué)差異（Shannon指數(shù)：H=15.661，P=0.004;Chao1指數(shù)：H=13.514，P=0.009），DSS處理后大鼠的腸道菌群的α多樣性降低（Shannon指數(shù)：P<0.05/10;Chao1指數(shù)：P<0.05/10），健脾組未能改善菌群的多樣性（Shannon指數(shù)：P=0.527;Chao1指數(shù)：P=0.668），而采取EN（Shannon指數(shù)：P<0.05/10;Chao1指數(shù)：P<0.05/10）以及EN+健脾（Shannon指數(shù)：P<0.05/10;Chao1指數(shù)：P<0.05/10）的聯(lián)合處理能改善微生物的多樣性。其中EN+健脾組大鼠腸胃菌群的α多樣性高于EN組（Shannon指數(shù)：P<0.05/10;Chao1指數(shù)：P<0.05/10），見圖5。

四、對大鼠腸道菌群構(gòu)成比的影響

各組之間腸道菌群構(gòu)成存在統(tǒng)計學(xué)差異（H=16.61，P<0.001）。在門水平上，與空白組相比，模型組中潛在腸道病原體（變形菌門和擬桿菌門）的相對豐度增加（P<0.05/10），而潛在有益菌（厚壁菌門）下降（P<0.05/10）;在科水平上，UC大鼠的雙歧桿菌和乳桿菌科的相對豐度均下降（P<0.05/10），而腸桿菌科增加（P<0.05/10）;這些結(jié)果提示UC大鼠的腸道正常菌群結(jié)構(gòu)被破壞。值得注意的是，與模型組相比，EN（P<0.05/10）和EN+健脾（P<0.05/10）處理均能抑制腸桿菌和擬桿菌科菌群的生長，降低其相對豐度，促進乳桿菌和雙歧桿菌科菌群的生長，提高其相對豐度;此外，與EN組相比，EN+健脾組能夠進一步增加有益細菌相對豐度及降低有害菌的相對豐度（P<0.05/10），見圖6。

討論

據(jù)報道，UC在人群中的發(fā)病率為35/10萬～100/10萬[10]。此外，一項全球性流行病學(xué)研究報告稱，近年來亞洲的UC發(fā)病率增長較快[11]。長期反復(fù)的UC嚴重影響患者的生活質(zhì)量和勞動能力，但UC的病因和發(fā)病機制仍不清楚，目前認為可能與遺傳易感性、腸道菌群及免疫因素有關(guān)[1]。

DSS誘導(dǎo)大鼠急性UC的臨床癥狀或病理變化與人類UC非常相似，同時DSS飲用水建模方法簡單，可重現(xiàn)高，故本研究中應(yīng)用這一經(jīng)典的UC建模方法[12]。EN支持是UC治療的一個重要手段，它在改善機體的營養(yǎng)狀況的同時，有維護腸黏膜屏障、促進腸黏膜上皮修復(fù)的作用，從而減少腸道細菌和內(nèi)毒素的易位[3]。但EN實施效果個體差異較大，部分UC患者使用后出現(xiàn)胃腸不耐受的癥狀如腹脹腹瀉等，使EN不能有效發(fā)揮作用，UC的癥狀得不到明顯改善。近年來有不少研究探索中醫(yī)和西醫(yī)的聯(lián)合治療，并已證明多個中醫(yī)藥方有助于改善UC的癥狀，如實驗研究發(fā)現(xiàn)半夏瀉心湯與黃芩湯具有抗炎和抗氧化的效果，能緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[13-14]。本研究探索聯(lián)合應(yīng)用健脾方和EN對UC的效果。實驗結(jié)果表明，單純EN能緩解UC的癥狀，與以前的研究一致[15]。另外，健脾方和EN的聯(lián)合干預(yù)可進一步緩解UC大鼠的臨床癥狀和減少病理損害，表明健脾方聯(lián)合EN用于UC比單獨使用EN更有效，其機制可能是健脾中藥增強了EN的黏膜修復(fù)功能。

人體的腸道菌群數(shù)量龐大、種類繁多，包括益生菌、共生菌和致病菌群三大類，它們構(gòu)成了一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，正常情況下的腸道各類細菌處于一種動態(tài)平衡，有助于維持宿主的“健康狀態(tài)”。很多因素包括疾病、飲食結(jié)構(gòu)、藥物等都可能對腸道菌群的構(gòu)成和功能產(chǎn)生不同的影響。一旦腸道菌群平衡受到破壞，就可引起黏膜層的過度消耗和腸黏膜上皮細胞凋亡加速，導(dǎo)致腸黏膜屏障的受損[4]。另外，當(dāng)致病菌數(shù)量增加會引發(fā)強烈的腸道免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸道多種炎癥因子分泌增加，后者又進一步加重腸道菌群的紊亂并對腸道黏膜造成更大的損害，并最終誘導(dǎo)或促進UC的形成和消化吸收功能障礙[16]。近年來越來越多的研究關(guān)注UC和腸道菌群之間的關(guān)系，腸道菌群平衡已被認為是UC發(fā)病的關(guān)鍵因素之一[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)UC患者存在著腸道菌群失調(diào)，是影響本病的重要內(nèi)環(huán)境因素。其中UC患者的腸道菌群通常表現(xiàn)出病原菌數(shù)量不斷增加，而益生菌減少，UC患者的血清中對微生物抗原的抗體水平高于健康對照[17]。

在本研究中，通過16SrRNA基因測序，我們進一步研究了健脾方和EN處理對UC大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC模型組腸道菌群的結(jié)構(gòu)顯著改變，表現(xiàn)為與對照組相比，擬桿菌和變形桿菌的豐度增加，而厚壁菌的豐度降低，并且細菌α多樣性降低。結(jié)果與之前的研究基本一致[4，18-19]。EN以及EN和健脾的聯(lián)合處理都能顯著改善UC大鼠腸道菌群，使其菌群構(gòu)成及細菌豐度趨于正常。值得一提的是，健脾方聯(lián)合EN給藥與單獨EN相比，能夠增加腸道菌群的多樣性，降低潛在致病菌群的相對豐度，表明兩者的聯(lián)合處理更有利于維護正常菌群，對致病菌有更強的抑制作用。另外在腸道菌群中，乳桿菌和雙歧桿菌被證實是對人體有益的細菌，有研究證明它們能上調(diào)腸上皮緊密連接蛋白的表達對腸黏膜具有保護作用，并可改善結(jié)腸炎的臨床癥狀[20-21]。本研究結(jié)果顯示，乳桿菌和雙歧桿菌的相對豐度在UC大鼠中降低，與一些文獻的結(jié)果一致[21]。EN聯(lián)合健脾的干預(yù)較單獨EN能進一步提高UC大鼠腸道中乳桿菌和雙歧桿菌的豐度，表明其對UC大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)有更積極的調(diào)節(jié)作用。即健脾和EN的聯(lián)合作用可能是通過抑制UC大鼠中腸道有益細菌的減少和病原細菌的生長，來維持腸道菌群的穩(wěn)定性，進而為緩解UC大鼠的癥狀提供有力條件。

綜上所述，健脾法聯(lián)合EN可能通過調(diào)節(jié)UC大鼠腸道菌群的穩(wěn)態(tài)和多樣性，增加益生菌數(shù)量，降低潛在致病菌數(shù)量，從而緩解大鼠腸道炎癥。