安春梅，陶積陽，蘇紅梅，黃文功，張桂征，黃玲莉，韋博尤，黃勝，閉立輝

（廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站，南寧530007）

家蠶血液型膿病是造成蠶業(yè)生產(chǎn)減產(chǎn)的主要病害之一，在廣西亞熱帶高溫季節(jié)尤為嚴(yán)重。我國各級蠶業(yè)科研機(jī)構(gòu)對其研究已有很長一段時間，但直到廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站（現(xiàn)廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站）育成桂蠶N2[1]和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所育成華康系列[2]品種后，才從產(chǎn)業(yè)的源頭上大幅降低了血液型膿病的發(fā)生。而后全國各省也陸續(xù)引進(jìn)和育成更多的抗血液型膿病家蠶新品種。抗血液型膿病品種的育成與推廣為穩(wěn)定蠶業(yè)生產(chǎn)、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的保障。

家蠶對BmNPV抵抗性受常染色體上一對顯性主基因控制，也受其他微效修飾基因影響[3]。錢荷英等[4]對15個抗膿病品種與非抗膿病品種SNP研究得到第27連鎖群上50個抗性標(biāo)記。吳凡等[5]對21個家蠶品種資源研究發(fā)現(xiàn)中系品種間不存在顯著差異，而日系品種資源間存在顯著差異。劉勇等[6]研究表明家蠶體內(nèi)脂肪酶BmLipase-1基因表達(dá)水平高低與其抗BmNPV性能強(qiáng)弱一致，可作為家蠶抗BmNPV育種過程選擇與鑒定依據(jù)之一。張正斌等[7]進(jìn)行親本和雜交分離群體的基因組測序，結(jié)果表明與BmNPV抗性相關(guān)的SNP標(biāo)記分布在多個染色體上，推測抗性品系的BmNPV高抗性與抗性主基因和其他抗性基因的聯(lián)合作用有關(guān)。

廣西對亞熱帶抗BmNPV品種選育研究已有一定的歷史。閉立輝等[8-9]對兩廣二號4個親本及其他品種進(jìn)行抗BmNPV能力研究，發(fā)現(xiàn)品種間對BmNPV的抗性有著極顯著差異。通過用抗BmNPV強(qiáng)的品種與經(jīng)濟(jì)性狀好但易感BmNPV的蠶品種進(jìn)行雜交、回交等，多代不間斷經(jīng)口接種進(jìn)行個體和蛾區(qū)選擇，生產(chǎn)用抗BmNPV母種有必要進(jìn)行BmNPV接種保持其抗性[10]。近十來年，廣西家蠶遺傳育種研究團(tuán)隊對育種素材利用高溫多濕飼養(yǎng)環(huán)境和添食BmNPV綜合篩選方式，不斷提高育種素材抗BmNPV和抗高溫多濕的優(yōu)良性能，同時兼顧全繭量、繭層率等經(jīng)濟(jì)性狀，篩選出4對優(yōu)良的雜交組合參加廣西農(nóng)作物品種審定，旨在豐富抗血液型膿病實用品種，提高綜合經(jīng)濟(jì)性狀，使抗BmNPV、抗高溫多濕與繭絲質(zhì)量等指標(biāo)有所提高，育成新的實用品種并推廣應(yīng)用，降低農(nóng)村生產(chǎn)上血液型膿病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站（下稱廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站）家蠶遺傳育種研究室蠶室。

1.2 參試品種

對照種：兩廣二號正交和反交，由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站提供。

試驗種：4對亞熱帶型抗BmNPV家蠶四元雜交種正交和反交，于2018年育成并參加廣西農(nóng)作物新品種鑒定，分別暫命名為9878N、9芙78N、98N7H和9芙N7H。前兩對為白繭品種，4個雜交親本均抗BmNPV；后兩對為金黃繭品種，僅其一親本抗BmNPV。試驗用種由廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣站家蠶遺傳育種研究室提供。

1.3 抗性測試試驗方法

BmNPV的濃度選取1×106、1×107、1×108、1×109個/mL共4個濃度梯度，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)區(qū)，每區(qū)50頭蠶，于2齡起蠶喂食浸泡過設(shè)定濃度的BmNPV溶液后表面水漬晾干的桑葉，第2次給葉改為正常桑葉。維持蠶房溫度28～30℃，相對濕度80%～90%。飼養(yǎng)期間詳細(xì)記錄因膿病或者非膿病引起的死蠶，對無法確定死因的個體采用顯微鏡檢驗確認(rèn)是否因感染BmNPV致死，2齡將眠至3齡第2次喂葉期間調(diào)查發(fā)病數(shù)量和存活數(shù)量，用SPSS回歸分析Probit方法計算半致死濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 對照種兩廣二號抗BmNPV性能評價

試驗結(jié)果顯示兩廣二號在添食BmNPV的濃度1×106個/mL下時，正交和反交均有比較多的膿病蠶發(fā)生。當(dāng)添食BmNPV的濃度為1×107個/mL時，膿病蠶的發(fā)生率已超過了70%。當(dāng)添食BmNPV的濃度為1×109個/mL時，所有蠶全部發(fā)病死亡。采用SPSS 19 PROBIT方法計算BmNPV對兩廣二號正交和反交的半致死濃度（LC50）分別為2.60×106和4.23×106個/mL，綜合正交和反交，最小致死濃度（LC01）為2.57×104個/mL，半致死濃度（LC50）為3.31×106個/mL，致死濃度（LC99）為4.26×108個/mL，詳見表1、圖1。

表1 兩廣二號致死濃度分析

2.2 新品種抗BmNPV性能評價

4對新品種“9芙78N”“9芙N7H”“9878N”“98N7H”在各個添食濃度下均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗BmNPV性能（詳見表2），所有新品種均未發(fā)現(xiàn)有超過10%發(fā)病率的試驗區(qū)，即使是添食BmNPV最高濃度1×109個/mL發(fā)病率也很低，甚至沒發(fā)病。本試驗預(yù)估計的最高添食濃度未達(dá)到半致死濃度，未能計算出LC50。從BmNPV的4個添食濃度情況來看，9芙78N正交和反交在4個添食濃度中未發(fā)現(xiàn)有膿病個體，98N7H也僅發(fā)現(xiàn)1頭蠶染病，9芙N7H和9878N也僅表現(xiàn)出少量的發(fā)病個體，4個新品種均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗BmNPV能力。

表2 添食BmNPV試驗區(qū)總病蠶頭數(shù)和發(fā)病率

與對照種兩廣二號相比，在對照種的BmNPV半致死濃度（LC50）為106個/mL添食濃度水平上，4對新品種僅個別區(qū)出現(xiàn)極少量個體發(fā)生膿病。在對照種的BmNPV致死濃度（LC99）為108個/mL添食濃度水平上時，4對新品種亦未表現(xiàn)出明顯的發(fā)病。發(fā)病最高的為黃繭品種9芙N7H正交，發(fā)病率為8.05%；在BmNPV的添食濃度為109個/mL時，所有新品種也表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗性，發(fā)病率最高的9878N反交，發(fā)病率僅為2.80%。4對抗病新品種在最高添食濃度水平發(fā)病率均遠(yuǎn)低于對照在最低添食濃度水平的發(fā)病率。

3 結(jié)論與討論

3.1 新品種抗BmNPV性能評價

從試驗結(jié)果來看，對照種兩廣二號的BmNPV半致死濃度（LC50）為3.31×106個/mL，4對抗BmNPV新品種“9芙78N”“9芙N7H”“9878N”“98N7H”在BmNPV添食濃度1×109個/mL水平下發(fā)病率均遠(yuǎn)低于50%，推測BmNPV的半致死濃度（LC50）高于1×109個/mL。4對新品種半致死濃度（LC50）均比對照高100倍以上，對比添食最低濃度和最高濃度的膿病發(fā)生率，4對抗BmNPV新品種在添食BmNPV最高濃度為1×109個/mL時，血液型膿病發(fā)生率遠(yuǎn)低于對照種在添食BmNPV最低濃度1×106個/mL時的發(fā)病率，推測4對抗BmNPV新品種的抗BmNPV性能均比兩廣二號高1 000倍以上，均具有非常高的抗BmNPV性能。

3.2 白繭品種與金黃繭品種抗BmNPV抗性比較

兩對金黃繭品種“9芙N7H”和“98N7H”兩個中系親本為抗BmNPV品種，兩個日系金黃繭親本未導(dǎo)入抗BmNPV基因，兩對白繭新品種“9芙78N”和“9878N”4個雜交親本均為抗BmNPV品種。對比黃繭與白繭新品種的在不同病毒濃度梯度下抗病性能，4對新品種的發(fā)病率均極低，未表現(xiàn)出顯著差異。

3.3 抗BmNPV新品種半致死濃度測定技術(shù)探討

國內(nèi)育成的家蠶抗BmNPV新品種的半致死濃度大多超過1×109個/mL，但BmNPV濃度在109個/mL及以上等級下很難直接準(zhǔn)確使用血球計數(shù)板測量BmNPV的濃度，主要是通過稀釋后間接測量估算，具有較大的試驗誤差。此外高濃度的BmNPV懸浮液粘度強(qiáng)，通過浸泡、涂抹桑葉添食或直接定量喂食均存在比較大的誤差，限制了本試驗對抗血液型膿病的半致死濃度測試。