蔡霈 鄭藝 王哲明

[摘要] 目的 優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝。 方法 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以醇沉前液相對(duì)密度、乙醇終濃度與靜置時(shí)間為考察因素，以綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B、去甲異波爾定、甘草苷、延胡索乙素、落新婦苷的轉(zhuǎn)移率與固體去除率的綜合評(píng)分值為考察指標(biāo)，采用基于Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝。色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～10 min，2% A;10～40 min，2%～12% A;40～80 min，12%～18% A;80～110 min，18%～25% A;110～120 min，25%～50% A），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200～400 nm。 結(jié)果 最佳醇沉工藝條件為醇沉前液相對(duì)密度1.13，乙醇終濃度60%，靜置時(shí)間21 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相對(duì)偏差為0.7%。 結(jié)論 優(yōu)化的醇沉工藝方法簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便且結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定，可為盆炎靈顆粒的制劑生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] Box-Behnken;響應(yīng)面法;醇沉工藝;轉(zhuǎn)移率;固體去除率

[中圖分類號(hào)] R284.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）08（a）-0032-06

[Abstract] Objective To optimize the ethanol precipitation process for Penyanling Granules. Methods Based on the single factor test， the relative density of the liquid before ethanol precipitation， the final ethanol concentration and the ethanol precipitation time were used as factors. The transfer rates of chlorogenic acid， paeoniflorin， ferulic acid， salvianolic acid B， norisoboldine， liquiritin， tetrahydropalmatine， astilbin and the composite score of solid removal rate were selected as evaluation indexes. The ethanol precipitation process of Penyanling Granules was optimized by Box-Behnken response surface method. Chromatographic conditions： the column was Agilent TC-C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， the flow rate was 1.0 mL/min. The mobile phase A was acetonitrile and the mobile phase B was 0.2% phosphoric acid solution with gradient elution （0-10 min， 2% A; 10-40 min， 2%-12% A; 40-80 min， 12%-18% A; 80-110 min， 18%-25% A; 110-120 min， 25%-50% A）. The column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 200-400 nm. Results The optimal ethanol precipitation process was as followed： the relative density of the extract was 1.13， and ethanol was added to allow the content of ethanol to reach 60%， and then been placed for 21 h. The test results indicated that the relative difference of comprehensive scoring value between predicated value and measured value was 0.7%. Conclusion The optimal ethanol precipitation process is simple， easy to operate and the results are accurate and stable， which can provide a reliable theoretical basis for the preparation production of Penyanling Granules.

[Key words] Box-Behnken; Response surface methodology; Ethanol precipitation process; Transfer rate; Solide removal rate

盆炎靈顆粒是已在湖南省婦幼保健院臨床使用20年的中藥復(fù)方制劑，由醋延胡索、香附、敗醬草、丹參、茯苓等多味中藥材組成，具有通暢血脈、消散瘀滯、消炎鎮(zhèn)痛等功效，主要用于婦科盆腔炎性疾病的治療[1]。中藥制劑的醇沉工藝是在制劑過(guò)程中應(yīng)用不同濃度乙醇將其除雜、精制有效成分的關(guān)鍵步驟，具有工藝成熟、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能夠減少患者日服用劑量，增加患者順應(yīng)性，同時(shí)減少顆粒的吸濕性，使其成型性更好，增加制劑的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間[2-5]。由于中藥成分復(fù)雜，對(duì)于中藥復(fù)方的醇沉工藝研究需要在處理過(guò)程中同時(shí)考慮多味藥材的有效成分含量以及固體去除率的變化。本試驗(yàn)采用基于Box-Behnken的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-結(jié)合響應(yīng)面法[6-9]，以醇沉后樣品中綠原酸、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B、去甲異波爾定、甘草苷、延胡索乙素、落新婦苷的轉(zhuǎn)移率和固體去除率的綜合評(píng)分值為考察指標(biāo)，優(yōu)化盆炎靈顆粒的醇沉工藝，為規(guī)范盆炎靈顆粒的生產(chǎn)工藝以及后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-10AT高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司），SPD-M20A檢測(cè)器（日本島津公司），SB25-12DTN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），Mettler Toledo XS205型電子分析天平（德國(guó)梅特勒-托利多公司，精度萬(wàn)分之一），0.22 μm微孔濾膜（美國(guó)密理博公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

盆炎靈顆粒處方中各味藥材從湖南衡東縣中藥飲片廠購(gòu)買，當(dāng)歸（20170316，甘肅）、丹參（20170626，河北）、大血藤（20170317，湖南）、烏藥（20170318，安徽）、敗醬草（20170316，湖南）、赤芍（20170316，四川）、三棱（20170317，廣西）、醋延胡索（20170316，浙江）、醋香附（20170319，安徽）、甘草（20170316，內(nèi)蒙古）、土茯苓（20170316，廣東）經(jīng)湖南省中醫(yī)院王竹鑫主任藥師鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》[10]中各項(xiàng)規(guī)定。

8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為綠原酸、去甲異波爾定、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110753-201411、111825-201402、110736-201604、110773-201614、111610-201106、111798-201504、110726-201617、111562-201212，純度≥98%，用于含量測(cè)定）;乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）為蒸餾水自制，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸、去甲異波爾定、芍藥苷、阿魏酸、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件? 色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）;梯度洗脫：0～10 min，2% A;10～40 min，2%～12% A;40～80 min，12～18% A;80～110 min，18～25% A;110～120 min，25～50% A;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：200～400 nm（綠原酸：327 nm;阿魏酸：316 nm;甘草苷：237 nm;芍藥苷：230 nm;延胡索乙素：280 nm;去甲異波爾定：280 nm;丹酚酸B：286 nm;落新婦苷：291 nm）;進(jìn)樣量：10 μL[11]?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC圖譜見圖1。

A：混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜;B：盆炎靈顆粒劑HPLC圖譜。1.綠原酸;2.去甲異波爾定;3.芍藥苷;4.阿魏酸;5.甘草苷;6.落新婦苷;7.延胡索乙素;8.丹酚酸B。HPLC：高效液相色譜法

2.1.2 對(duì)照品溶液配制? 精密稱取綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，加甲醇分別配制成濃度為1.721、3.111、0.415、0.239、0.345、0.694、2.686、0.168 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)即為對(duì)照品溶液。取上述8種對(duì)照品置于同一容量瓶中，以甲醇定容，混合液中各對(duì)照品濃度與上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液相同，即得混合對(duì)照品溶液。各標(biāo)準(zhǔn)曲線制作、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及加樣回收率試驗(yàn)已在相關(guān)研究[12]中完成，均符合要求。

2.1.3 供試品溶液的制備? 量取盆炎靈提取液或醇沉上清液適量，相當(dāng)于生藥材25 g，置于25 mL的錐形瓶中，加入甲醇定容，搖勻，轉(zhuǎn)速5000 r/min，離心半徑為10 cm，離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即為供試品溶液。

2.2 物質(zhì)轉(zhuǎn)移率的測(cè)定

取“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的物質(zhì)量，并按下式計(jì)算各物質(zhì)的轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移率=醇沉上清液中物質(zhì)量/盆炎靈提取液中物質(zhì)量×100%。

2.3 固體去除率的測(cè)定

精密吸取盆炎靈提取液或醇沉上清液適量（相當(dāng)于生藥材25 g），置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后于105℃干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，恒重后精密稱定質(zhì)量，計(jì)算固體去除率。固體去除率=（盆炎靈提取液干膏質(zhì)量-醇沉上清液干膏質(zhì)量）/盆炎靈提取液干膏質(zhì)量×100%。

2.4 單因素考察

單純以各有效物質(zhì)轉(zhuǎn)移率或固體去除率來(lái)評(píng)價(jià)醇沉工藝的優(yōu)劣，可能會(huì)出現(xiàn)有效物質(zhì)與雜質(zhì)同時(shí)保留或去除的情況，難以得到合理的結(jié)果。因此在本研究中，采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)法對(duì)盆炎靈提取液醇沉工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。中藥水提液醇沉工藝權(quán)重系數(shù)的設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)在優(yōu)先保留有效成分的前提下，盡可能多地去除雜質(zhì)，故設(shè)置固體去除率權(quán)重系數(shù)為40[13-14]。綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)均為7.5（各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)權(quán)重系數(shù)相等），在此基礎(chǔ)上進(jìn)行綜合評(píng)分。

利用綜合評(píng)分值（P）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析：以Y表示試驗(yàn)中指標(biāo)成分的測(cè)定值（綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉(zhuǎn)移率及固體去除率的測(cè)定值分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9），Z表示指標(biāo)成分的測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)（Z=Y/Ymax）[9]，綜合評(píng)分值P=（Z綠原酸+Z芍藥苷+Z去甲異波爾定+Z甘草苷+Z落新婦苷+Z延胡索乙素+Z丹酚酸B+Z阿魏酸）×7.5+Z固體去除率×40。

2.4.1 醇沉前液相對(duì)密度? 在乙醇終濃度為60%、靜置時(shí)間為24 h的情況下，考察醇沉前液相對(duì)密度分別為1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30。將醇沉上清液按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后進(jìn)行分析，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉(zhuǎn)移率，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定固體去除率，并按綜合評(píng)分法進(jìn)行計(jì)算。以醇沉前液相對(duì)密度1.15時(shí)，綜合評(píng)分最高。見圖2。

2.4.2 乙醇終濃度? 在醇沉前液相對(duì)密度為1.15、靜置時(shí)間為24 h的情況下，考察乙醇終濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%。將醇沉上清液按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后進(jìn)行分析，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉(zhuǎn)移率，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定固體去除率，并按綜合評(píng)分法進(jìn)行計(jì)算。以乙醇終濃度為60%時(shí)，綜合評(píng)分最高。見圖3。

2.4.3 靜置時(shí)間? 在醇沉前液相對(duì)密度為1.15、乙醇終濃度為60%的情況下，考察靜置時(shí)間分別為4、8、16、24、32、40 h。將醇沉上清液按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液后進(jìn)行分析，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸、芍藥苷、去甲異波爾定、甘草苷、落新婦苷、延胡索乙素、丹酚酸B、阿魏酸的轉(zhuǎn)移率，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定固體去除率，并按綜合評(píng)分法進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)靜置時(shí)間達(dá)到16 h時(shí)后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，綜合評(píng)分值無(wú)明顯變化。見圖4。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

2.5.1 Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果? 經(jīng)上述單因素試驗(yàn)確定考察因素分別為A（醇沉前液相對(duì)密度）、B（乙醇終濃度，%）、C（靜置時(shí)間，h）。采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察因素與考察水平見表1。

按照前述評(píng)分方法，利用P對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見表2。

應(yīng)用Design-Expert 10.0軟件對(duì)各試驗(yàn)的綜合評(píng)分值進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為：P=89.84-0.077A+5.64B+2.34C+5.90AB-2.32AC-4.36BC-2.90A2-20.24B2-1.45C2（R2 = 0.9986）。方程中一次項(xiàng)的系數(shù)絕對(duì)值表明各因素對(duì)綜合評(píng)分值的影響程度。由上述回歸方程可知，各考察因素對(duì)盆炎靈醇沉工藝的影響程度為B>C>A。對(duì)回歸方程進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)方差分析，見表3。

用F檢驗(yàn)來(lái)判定回歸方程中各考察因素對(duì)綜合評(píng)分值的影響，概率P < 0.01時(shí)為高度顯著影響，概率P < 0.05時(shí)為顯著影響。由表3可知，模型概率P < 0.01，提示該模型具有高度顯著性，R2 = 0.9986，提示模型擬合程度好。應(yīng)用Design-Expert 10.0軟件考察醇沉前液相對(duì)密度、乙醇終濃度和靜置時(shí)間的兩兩相互作用對(duì)醇沉工藝的影響，繪制了該實(shí)驗(yàn)條件的響應(yīng)面圖，得到3個(gè)開口向下的凸形曲面。考察的3個(gè)因素與盆炎靈顆粒醇沉工藝綜合評(píng)分值呈拋物線關(guān)系，并且在考察的實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，存在著響應(yīng)值的極大值。見圖5。

經(jīng)過(guò)中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化醇沉條件，最優(yōu)工藝條件：醇沉前液相對(duì)密度1.125、乙醇終濃度60.83%、靜置時(shí)間21.10 h。

2.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn)? 參照上述最優(yōu)醇沉工藝，并結(jié)合試驗(yàn)條件的可操作性，調(diào)整為醇沉前液相對(duì)密度1.13，乙醇終濃度60%，靜置時(shí)間21 h，綜合評(píng)分值為90.8773。按照該優(yōu)化工藝進(jìn)行3批次醇沉驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果綜合評(píng)分值為90.2759，與預(yù)測(cè)值比較，相對(duì)偏差為0.7%（<5%）。見表4。

3 討論

本研究首先通過(guò)單因素試驗(yàn)初步篩選使各因素水平能夠在星點(diǎn)設(shè)計(jì)范圍之內(nèi)，以提高試驗(yàn)設(shè)計(jì)的精確性;之后采用Box-Behnken響應(yīng)曲面分析法，建立盆炎靈顆粒純化工藝的二次回歸數(shù)學(xué)模型，并分析了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。中藥醇沉工藝的探索中，常用正交試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行研究，但正交試驗(yàn)僅能給出最佳因素水平組合，不能優(yōu)化出更好的條件[15-17]，而Box-Behnken響應(yīng)曲面分析法能夠通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，構(gòu)建影響因素與響應(yīng)值之間的擬合模型，從而推算出最佳工藝條件。對(duì)于多因素試驗(yàn)研究，Box-Behnken響應(yīng)面法是最佳的分析方法[18-21]。從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，本研究中所建立的數(shù)學(xué)模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小。最佳的盆炎靈顆粒醇沉純化工藝條件：醇沉前液相對(duì)密度1.13、乙醇終濃度60%、靜置時(shí)間21 h。在此醇沉條件下盆炎靈顆粒中各主要有效物質(zhì)的轉(zhuǎn)移率均>70%，且與預(yù)測(cè)值相差較小。由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的盆炎靈顆粒醇沉工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型具有指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)的意義。對(duì)所選取指標(biāo)進(jìn)行了合理的權(quán)重系數(shù)分配，使得有效物質(zhì)轉(zhuǎn)移率結(jié)合固體去除率的綜合評(píng)分更加合理，為盆炎靈顆粒制劑生產(chǎn)的工藝優(yōu)化提供參考依據(jù)。

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（收稿日期：2019-12-13）