胡芳雨，孟凡波，張聞*，高永超，鄭立穩(wěn)

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院），山東省科學院生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，濟南250103；2.濟南市環(huán)境研究院，濟南250102）

多 環(huán) 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是環(huán)境中廣泛存在的一類典型持久性有機污染物，大多具有“三致”效應，可通過空氣或水進行長、短距離輸送，參與全球和各圈層的循環(huán)，最終在土壤中累積，并通過土壤-作物系統(tǒng)遷移、積累、轉化，進而危及生態(tài)系統(tǒng)和人體健康[1]。因此，研究PAHs污染土壤修復對農業(yè)安全和環(huán)境保護具有重要意義。國內外學者對有機污染土壤修復技術開展了大量研究，植物修復是最具潛力的土壤生物修復技術之一[2-3]。植物的存在能夠加快土壤中PAHs的去除，但由于PAHs的高疏水性，植物的直接吸收和積累作用在PAHs污染修復中作用并不大，而是根系分泌物發(fā)揮了巨大的作用[4]。

根系分泌物是植物根系在生命活動過程中向外界環(huán)境分泌的各種有機化合物的總稱，是植物與土壤、水、大氣進行物質、能量和信息交換的重要介質。根系分泌物所營造的根際微環(huán)境是有機污染物有效性和毒性得以快速消減的重要原因[5]。根系分泌物主要通過3種方式影響土壤中有機污染物的降解[6-7]：根系分泌的酶直接參與有機污染物的降解；根系分泌物通過改變根際微生物數(shù)量和活性或提供共代謝基質影響有機污染物的降解；根系分泌物改變土壤有機污染物的生物有效性，從而促進其降解。

在有機物污染脅迫下，植物根系分泌物會產生相應的變化[8]。謝明吉等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在菲（PHE）脅迫下，黑麥草根系分泌的低分子有機酸的組成無明顯變化，但其含量都比對照有顯著增加，且總糖和氨基酸含量均隨PHE質量濃度上升呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。Toyama等[10]研究表明，芘可導致蘆葦（Phragmites australis）根系產生的分泌物中酚類化合物含量上升。萬大娟等[11]采用水培方法對1，2，4-三氯苯（1，2，4-TCB）和滴滴涕（pp′-DDT）脅迫下的黑麥草和大豆根系分泌物含量變化進行了研究，結果表明有機物污染脅迫能使植物根系分泌物中的可溶性總糖、有機酸和氨基酸產生變化。根系分泌物的組分和濃度影響其在土壤有機污染修復過程中的作用。因此，有必要探明根系分泌物對有機污染脅迫的響應，這是研究根系分泌物環(huán)境效應的前提。

根系分泌物的種類繁多，氨基酸是其中一類重要組分[12]。氨基酸不僅能為植物和土壤微生物提供碳源和氮源，在生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)中起到關鍵作用[13-14]，還能夠參與有機污染土壤修復進程[15-18]，或為土壤微生物提供共代謝基質，或影響有機污染物在土壤中的生物有效性，進而促進有機污染物的降解。在有機污染物脅迫下，植物作出適應性響應，其根系代謝發(fā)生變化，根系分泌的氨基酸組分和含量可能隨之改變，進而影響氨基酸在促進有機污染物降解中的作用，因此有必要針對氨基酸組分研究其對有機污染脅迫的響應特征。黑麥草（Lolium perenne）具有對有機污染物較強的耐受力和在污染土壤中較強的生長能力，因而被作為修復有機污染土壤的模式植物得到廣泛應用[19]。本研究選取黑麥草為受試植物，以菲、芘、苯并（a）芘為PAHs代表物，探討不同種類及濃度PAHs脅迫下黑麥草根系分泌物中氨基酸組分及含量的變化特征，以期補充和完善植物根系分泌物對有機污染脅迫的響應體系，為深入研究黑麥草修復PAHs污染土壤作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供 試 藥 品 菲（Phenanthrene，純 度 ＞98%）、芘（Pyrene，純度＞98%）、苯并（a）芘[benzo（α）pyrene，純度＞96%]，均購自Sigma-Aldrich公司（美國）。供試植物為黑麥草（Loliumperenne）。

1.2 水培試驗

用3%的H2O2溶液對黑麥草種子消毒20 min，取出用無菌水沖洗3次，然后用無菌水浸泡過夜。次日將種子置于無菌培養(yǎng)皿濾紙中催芽。將催芽1 d后的種子嵌入自制聚四氟乙烯擱種板上（圖1）。擱板為杯狀，底部直徑6 cm，厚度2 mm，均勻分布50個嵌種孔，嵌種孔根據黑麥草種子大小設計直徑為1.5 mm。垂直面高1 cm，均勻分布4個掛繩孔。擱板采用聚四氟乙烯材質，以期在進行PAHs脅迫實驗和后續(xù)根系分泌物收集實驗時減少PAHs和根系分泌物組分在擱板上的吸附損失。將種子整板轉移至含170 mL無菌Hoagland′s營養(yǎng)液[20]的1 L量筒中，用聚四氟乙烯細繩控制擱板位置處于營養(yǎng)液液面處（圖2）。將量筒置于光照培養(yǎng)箱（光暗比14 h：10 h，25℃）培養(yǎng)15 d。然后將黑麥草苗連同聚四氟乙烯擱板一起轉移至含170 mL無菌半量營養(yǎng)液的量筒中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。無菌半量營養(yǎng)液分別進行如下處理：（1）對照組CK，營養(yǎng)液不添加PAHs。（2）PAHs脅迫組，營養(yǎng)液中添加了PAHs。PAHs脅迫組中，分別設置菲、芘和苯并（a）芘處理，每種PAHs設置低、高兩個濃度。菲處理為PHE-L（1.2 mg·L-1）和PHE-H（10 mg·L-1）；芘處理為PYR-L（0.4 mg·L-1）和PYR-H（10 mg·L-1）；苯并（a）芘處理為BAP-L（2μg·L-1）和BAP-H（20μg·L-1）。實驗共設置7個處理，每個處理設4個重復。

1.3 根系分泌物的收集

將聚四氟乙烯擱板及黑麥草整板取出，用無菌水沖洗擱板及黑麥草苗根部，整板放置于含100 mL滅菌水的高型燒杯中，用錫紙包裹燒杯底部避光，如圖3所示。將燒杯放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)箱條件同上）。收集的溶液過0.45μm水系濾膜，即得到黑麥草根系分泌物。對根系分泌物冷凍干燥，保存于-20℃冰箱待分析。

1.4 黑麥草生物量的測定

圖1聚四氟乙烯板Figure 1 Plate of teflon

圖2黑麥草的水培Figure 2 Hydroponics of Loliumperenne

圖3黑麥草根系分泌物的收集Figure 3 Collection of root exudates by Loliumperenne

黑麥草苗從聚四氟乙烯擱板上取下，分別用自來水、蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干，去掉種子殼，測定植株數(shù)目。分離莖葉和根，用萬分之一天平（德國，賽多利斯BSA224S）分別稱其鮮質量。然后105℃殺青2 h，在60℃下烘至恒質量，稱量其干質量。

1.5 氨基酸組分的測定

取凍干的根系分泌物樣品，用1 mL蒸餾水定容，充分溶解后用日立L-8900型氨基酸分析儀進行氨基酸組分的測定。測定的目標氨基酸為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸，其中脯氨酸的檢測波長為440 nm，其余為570 nm。泵1（緩沖液）流速0.40 mL·min-1，泵2（茚三酮）流速0.35 mL·min-1，進樣量20μL，分析時間53 min。離子交換柱規(guī)格4.6 mm ID×60 mm，型號#2622PH，柱溫57℃。氨基酸含量以每克植物干質量分泌的氨基酸組分計，μg·g-1。

1.6 數(shù)據處理

數(shù)據結果以平均值±標準偏差表示。Kolmogorov-Smirnov法檢驗實驗數(shù)據正態(tài)性，符合正態(tài)分布時采用獨立樣本T檢驗對處理組和對照組進行比較，不符合時則進行Mann-Whitney U檢驗。在采用獨立樣本T檢驗時，先運用Levene法檢驗方差齊性。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學顯著意義，P＜0.01為極顯著。統(tǒng)計學分析使用軟件SPSS19.0進行。

2 結果與討論

2.1 PAHs脅迫對黑麥草生物量的影響

在PAHs脅迫下，黑麥草生長過程中未表現(xiàn)出受害癥狀，顯示其較強的耐受能力，具體生物量如圖4所示。對照組及各處理組的黑麥草數(shù)目在116～135株范圍。對照組黑麥草平均干質量為4.4 mg·株-1，不同種類及濃度的PAHs脅迫處理使黑麥草干質量有不同程度的增加。低濃度菲脅迫使黑麥草干質量增加了52.3%（6.7 mg·株-1），高濃度菲使黑麥草干質量略有增加（4.9 mg·株-1），低濃度菲脅迫下黑麥草干質量的增加幅度更大，但統(tǒng)計學分析表明差異均不顯著（P＞0.05）。謝明吉等[9]做了菲對黑麥草影響的研究，結果表明黑麥草生物量隨菲濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，1 mg·L-1菲處理的黑麥草生物量最大，8 mg·L-1菲處理的黑麥草生物量與對照組無顯著差異，與本實驗結果相似。芘脅迫對黑麥草生物量的影響與菲不同。芘脅迫下（PYR-L和PYR-H），黑麥草生物量均為6.2 mg·株-1，相較于對照組有顯著增加（40.9%，P＜0.01），芘的濃度水平差異（0.4 mg·L-1和10 mg·L-1）未影響生物量的增加幅度。謝曉梅等[21]研究了濃度為3～9 mg·L-1的芘對黑麥草的脅迫作用，發(fā)現(xiàn)該濃度下的芘處理未對黑麥草生物量產生顯著影響。苯并（a）芘脅迫下，黑麥草干質量分別為5.4 mg·株-1（BAP-L）和5.7 mg·株-1（BAP-H），均高于對照組，即苯并（a）芘刺激了植物的生長，但統(tǒng)計學分析表明低濃度苯并（a）芘處理組與對照組差異顯著（P＜0.05），高濃度處理組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。潘聲旺等[22-23]研究了同為PAHs污染土壤修復植物的羊茅屬植物對芘和苯并（a）芘的脅迫響應，發(fā)現(xiàn)輕中度的芘及苯并（a）芘脅迫能刺激羊茅屬植物的生長，重度脅迫則抑制了其生長。在本研究中，不同種類及濃度的PAHs脅迫處理使黑麥草生物量有了不同程度的增加。有研究表明[24-25]，PAHs脅迫會對植物的生理生態(tài)產生影響，如植物生長（株高、根長、根表面積、葉面積等）、形態(tài)和組織結構、光合作用、抗氧化系統(tǒng)等，進而影響到最后的生物量，影響程度因污染物種類及濃度不同而異。本研究中，相同濃度（10 mg·L-1）脅迫下，菲對黑麥草生物量無顯著影響，芘則顯著增加了黑麥草生物量，二者效應不同。這可能源于菲、芘的性質差異（表1）導致根系對PAHs的吸收量不同。根系對PAHs的吸收有被動吸收和主動吸收[26]。被動吸收可視為分配過程，Kow大的污染物更易分配到植物根系的脂質中。主動吸收需載體協(xié)助，有研究報道[27]小麥根系細胞膜上的PAHs轉運載體對四環(huán)以下PAHs的親和力與PAHs的Kow值大小順序一致。因此，黑麥草根系可能對芘的吸收能力更強，PAHs進入根系后會影響復雜的植物生理過程，最終將差異體現(xiàn)于生物量。研究表明，在采用黑麥草修復PAHs污染場地時，PAHs的種類應予以考慮。

各組的根冠比見圖4。對黑麥草生物量有顯著促進作用的處理組（PYR-L&H及BAP-L）的根冠比與對照組無顯著差異，其他處理組也未產生顯著影響，說明PAHs脅迫未改變黑麥草生物量在根和莖葉上的分配比例。根冠比反映了地下部分與地上部分之間光合產物積累的關系，體現(xiàn)了植物對資源的分配策略。與對照組比較，每種PAHs處理的莖葉質量和根質量均存在增加趨勢，植物生長沒有受到抑制，這可能是植物未表現(xiàn)出顯著根冠比調整這一保護機制的原因。

2.2 PAHs脅迫對氨基酸總量的影響

PAHs對黑麥草分泌氨基酸總量的影響見圖5。對照組中，黑麥草分泌的氨基酸總量為（84.2±10.3）μg·g-1。在菲的脅迫下，黑麥草分泌的氨基酸總量均低于對照組（P＜0.01），說明菲對黑麥草氨基酸的分泌有抑制作用，且高濃度菲的抑制作用更強。Muratova等[29]研究了高粱對菲的響應。高粱具備PAHs修復潛力，10 mg·kg-1的菲脅迫對高粱分泌的氨基酸總量基本無影響，100 mg·kg-1則使分泌量降低78%。PYR-L使氨基酸總量略有降低，PYR-H使其增加，但與對照組相比均未產生顯著差異（P＞0.05），說明芘脅迫未顯著影響黑麥草分泌的氨基酸總量。許超等[30]研究發(fā)現(xiàn)玉米根系分泌的氨基酸總量隨著芘脅迫的加強而顯著增多，芘對羊茅屬植物的脅迫研究也有相似報道。在苯并（a）芘的脅迫下，BAP-L處理黑麥草氨基酸分泌總量低于對照組（P＜0.05），而BAP-H處理氨基酸總量高于對照組（P＞0.05），即低濃度苯并（a）芘顯著抑制了黑麥草氨基酸的分泌，高濃度苯并（a）芘能促進氨基酸的分泌，但效果不顯著。潘聲旺等[23]研究苯并（a）芘對不同修復潛力羊茅屬植物根系分泌物的影響得到，苯并（a）芘脅迫總體上促進了氨基酸的分泌，脅迫強度越大分泌量越多，這與本研究中黑麥草的表現(xiàn)略有差異。這表明相同脅迫條件下根系分泌物的釋放特征還受到植物自身基因型的特異性及其生理狀態(tài)影響，提示在采用植物修復技術處理PAHs污染土壤時，植物種類是需要考慮的重要因素。本研究設置的PAHs濃度，菲脅迫使黑麥草的氨基酸分泌量顯著降低，芘脅迫未產生顯著影響，苯并（a）芘在低濃度時表現(xiàn)為抑制效應，高濃度時未表現(xiàn)出顯著效應。3類PAHs產生不同的影響可歸因于各自的性質和濃度差異。PAHs對植物的脅迫主要通過影響根系吸收和體內代謝實現(xiàn)。PAHs對植物根系吸收過程的影響已在上文討論，其對植物代謝的影響與環(huán)數(shù)和濃度密切相關。高曦[31]的研究表明，PAHs能觸發(fā)蠶豆抗氧化反應，并對蠶豆根尖細胞有DNA損傷效應，隨著PAHs環(huán)數(shù)和分子量的增加，PAHs對根尖細胞DNA的損傷程度減小，隨著PAHs濃度的增大，其損傷效應增強。PAHs通過黑麥草根系吸收和體內代謝過程，將其性質和濃度的差異綜合作用結果在氨基酸的分泌量上得以表現(xiàn)。

表1 3種PAHs的基本理化性質[28]Table 1 Basic physico-chemical property of three PAHs

圖4 PAHs脅迫對黑麥草生物量的影響Figure 4 Effects of PAHs on the biomass of Loliumperenne

圖5 PAHs對黑麥草分泌氨基酸總量的影響Figure 5 Effects of PAHs on total amino acid excreted by Lolium perenne

2.3 PAHs脅迫對氨基酸組分的影響

不同種類及濃度的PAHs脅迫下黑麥草分泌的氨基酸組分及含量見表2。在對照組的黑麥草根系分泌物中檢出了10種氨基酸，分別是天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸、賴氨酸、組氨酸。其中纈氨酸和谷氨酸濃度相對較高，分別為（36.4±2.0）μg·g-1和（20.4±8.5）μg·g-1，占氨基酸總量的43%和24%。半胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸未被檢出。在PAHs脅迫下，黑麥草分泌出一些原本不分泌的氨基酸。芘和苯并（a）芘脅迫均使黑麥草分泌異亮氨酸及亮氨酸；高濃度芘和高濃度苯并（a）芘脅迫則使黑麥草分泌蛋氨酸，低濃度時無此現(xiàn)象。PAHs脅迫也使黑麥草停止分泌一些氨基酸組分。菲和苯并（a）芘脅迫使黑麥草不再分泌酪氨酸；低濃度芘和低濃度苯并（a）芘脅迫使黑麥草不再分泌組氨酸，高濃度時則無此現(xiàn)象。PAHs脅迫前后黑麥草均存在的氨基酸中，處理組與對照組有顯著差異的氨基酸有纈氨酸（除高濃度芘外，其他處理均顯著降低了其分泌）和谷氨酸（高濃度菲顯著降低其分泌）。

在PAHs脅迫下，濃度水平出現(xiàn)變化的氨基酸的理化性質如表3所示。亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在α-碳上都含有分支脂肪烴鏈，具有相似的化學結構，均屬于脂肪族中性氨基酸。PAHs脅迫促使黑麥草分泌異亮氨酸及亮氨酸，抑制分泌纈氨酸，可能是亮氨酸、異亮氨酸與纈氨酸之間作為性質相似的氨基酸，在植物體內存在拮抗作用。目前支鏈氨基酸之間的拮抗作用及機制在動物體內已有報道[32]，但在植物體內的作用了解尚少。根系分泌物中的氨基酸作為植物細胞進程的代謝產物，其組分和水平的變化是生物系統(tǒng)對環(huán)境變化的最終反映。王亞男等[33]對萱草修復石油烴污染土壤的根系代謝組學進行了分析，發(fā)現(xiàn)石油烴的存在改變了萱草根系的代謝，減少了甘氨酸、脯氨酸等氨基酸組分的含量，認為這是植物對石油烴暴露作出的代謝響應，是一種適應性響應。植物體內的氨基酸參與多條代謝通路的調控，影響植物的許多生理過程[34-36]。Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝是PAHs主要影響的代謝途徑，PAHs下調了水稻中谷氨酸等氨基酸的代謝。PAHs脅迫下，PAHs會被植物吸收，在植物體內水解、還原或氧化[38]，轉化為疏水性中間物，產生氧化脅迫和基因毒性。隨后，轉化物與氨基酸、糖或谷胱甘肽等發(fā)生共軛作用，形成親水性極強的極性分子。PAHs的轉化中間產物能與氨基酸發(fā)生共軛，干擾氨基酸的正常代謝，影響氨基酸的組分構成和分泌量。為減少毒害，植物體通過轉運蛋白的作用，將形成的可溶性綴合物區(qū)室化到液泡或轉到細胞壁，以減少它們對細胞正常代謝的影響。PAHs脅迫時，具備修復潛力的植物會表現(xiàn)出較強的環(huán)境適應性和生物活性上的可塑性，并體現(xiàn)于根系分泌物的釋放特征上，這種釋放特征可能是根系組織和細胞為了減輕污染物毒害進行的生理調節(jié)，也可能是污染物破壞了根系正常生理活動造成細胞內有機物質滲漏造成的。本研究中，對于受PAHs脅迫發(fā)生顯著變化的黑麥草根系分泌物中的氨基酸組分，它們的信號通路具體受到了怎樣的影響，會影響哪些植物生理過程，PAHs脅迫與氨基酸代謝響應之間有何關聯(lián)，其中的生化與分子機制有待進一步研究。

表2 PAHs脅迫對根系分泌物中氨基酸組分的影響（μg·g-1）Table 2 Effectsof PAHs on amino acid composition excreted by Loliumperenne（μg·g-1）

表3受PAHs影響的氨基酸理化性質Table 3 Characteristics of affected amino acids

氨基酸能夠參與有機污染土壤修復過程，并在其中發(fā)揮作用。楊傳杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)外源氨基酸對龍葵修復PAHs污染土壤具有強化作用，甘氨酸、谷氨酸及半胱氨酸復合處理（各0.3 mmol·kg-1）效果最佳，對土壤PAHs總量的去除率提高了4.46倍，推斷可能源于氨基酸為土壤微生物提供了共代謝基質。Sun等[16-17]以丙氨酸和絲氨酸為例研究了氨基酸對土壤中PAHs吸附、解吸及生物可利用性的影響，發(fā)現(xiàn)氨基酸降低了PAHs在土壤上的吸附，低濃度的氨基酸促進PAHs的解吸，高濃度則抑制解吸，隨氨基酸濃度增加，丁醇可提取態(tài)的PAHs含量增高。Huang等[7]研究了根系分泌物組分對土壤中多溴聯(lián)苯醚的解吸、生物可利用性、生物可降解性的影響，發(fā)現(xiàn)甘氨酸組分能夠促進BDE-28和BDE-47的解吸，增加丁醇可提取態(tài)的比例，提高了降解率。以上報道的氨基酸在本研究的黑麥草根系分泌物中多有檢出?？梢灶A測，在使用黑麥草修復PAHs污染土壤過程中，其根系分泌物中的氨基酸組分能夠參與修復過程，并可能會發(fā)揮積極作用。各組分氨基酸的分子組成和結構不同，其性質（如其兩性離子性、酸堿性、等電點等）也有所差異[39]，這種差異可能會影響其參與的化學及生化反應及其在生命代謝過程中所起的作用。宏量氨基酸組分不能替代微量組分，且組分間的不同配比可能會產生不同效應。受PAHs脅迫，黑麥草分泌的氨基酸組分及含量發(fā)生了變化，這種變化在根系分泌物參與污染土壤修復過程中會對土著微生物菌群、PAHs的賦存狀態(tài)及環(huán)境行為等方面產生影響，進而影響土壤中PAHs的去除效果。關注PAHs脅迫下黑麥草根系分泌物中氨基酸組分的響應，了解其變化的組分和含量，對于探索植物修復有機污染土壤的作用機制有重要意義。

3 結論

（1）無PAHs脅迫時，黑麥草根系分泌物的氨基酸總量為（84.2±10.3）μg·g-1，共檢出10種氨基酸，其中纈氨酸和谷氨酸濃度相對較高，各占氨基酸總量的43%和24%。

（2）PAHs脅迫使黑麥草生物量有不同程度的增加，并影響根系分泌氨基酸的總量及組分構成，其脅迫效應因PAHs種類和濃度而異。

（3）對于氨基酸總量，菲和低濃度苯并（a）芘均起抑制作用，且高濃度菲比低濃度抑制效應更強；其他處理無顯著影響。

（4）對于氨基酸組分構成，菲使黑麥草不再分泌酪氨酸并抑制了纈氨酸的分泌，高濃度時還對谷氨酸分泌起抑制作用。芘的存在使黑麥草開始分泌異亮氨酸及亮氨酸，高濃度時還可促使蛋氨酸分泌，低濃度時則抑制了纈氨酸的分泌且使黑麥草不再分泌組氨酸。苯并（a）芘使黑麥草開始分泌異亮氨酸、亮氨酸，而不再分泌酪氨酸，并抑制了纈氨酸的分泌，此外，高濃度時還使黑麥草開始分泌蛋氨酸，低濃度時則另使黑麥草不再分泌組氨酸。