白 藍，劉 媛

（四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院化學(xué)實驗教學(xué)中心，四川 成都 610064）

創(chuàng)新型人才是貫徹國家自主創(chuàng)新戰(zhàn)略、建設(shè)創(chuàng)新型國家的重要力量，而高等學(xué)校擔(dān)負(fù)著培養(yǎng)創(chuàng)新型人才的重要使命[1]?；瘜W(xué)是一門以實驗為基礎(chǔ)的自然科學(xué)，在扎實的理論知識基礎(chǔ)上依靠動手實驗，可以循序漸進地培養(yǎng)學(xué)生的“創(chuàng)新意識—創(chuàng)新能力—創(chuàng)新精神”，因此高?；瘜W(xué)實驗教學(xué)是創(chuàng)新教育的有效途徑和重要手段[2-3]。然而目前的化學(xué)實驗教學(xué)過于強調(diào)對基本原理、操作步驟的死記硬背，學(xué)生只能被動實驗，導(dǎo)致學(xué)生知識結(jié)構(gòu)缺乏整體性和實際應(yīng)用性，最終失去了求知欲和創(chuàng)造力。因此，亟需對實驗教學(xué)內(nèi)容進行精心設(shè)計，充分利用化學(xué)實驗中化學(xué)現(xiàn)象的直觀性、化學(xué)反應(yīng)的趣味性、化學(xué)實驗的動感性、化學(xué)知識的生活化，激發(fā)學(xué)生主動參與的意愿與強烈的求知欲望[4]。并且，在教學(xué)中提倡以“學(xué)生為主體”的“自主性學(xué)習(xí)”，要求學(xué)生不僅熟練掌握預(yù)先學(xué)習(xí)的理論知識，更能對實驗中存在的問題層層剖析、深入探討，從而主動補充學(xué)習(xí)新知識，甚至在解決問題的過程中提出新問題[5-6]。因此，通過安全綠色、簡單易行的探索型有機化學(xué)實驗課程，以生動有趣的實驗現(xiàn)象吸引學(xué)生主動參與實驗，并采用分層次教學(xué)對不同背景、不同層次的學(xué)生進行訓(xùn)練[7]，從而培養(yǎng)具有突出理解能力、研究能力和創(chuàng)新能力的人才。

1 實驗背景

綠色熒光蛋白質(zhì)（green fluorescent protein，GFP）發(fā)現(xiàn)于美國西北海岸的Aequoreavictori水母體內(nèi)，其序列中的氨基酸殘基（Ser-65，Tyr-66，Gly-67）可以自發(fā)形成的一種具有噁唑酮結(jié)構(gòu)的熒光發(fā)色團，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示[8]。

圖1 GFP 唑酮熒光發(fā)色團結(jié)構(gòu)通式

唑酮熒光發(fā)色團因具有4 位的環(huán)外雙鍵而高度共軛，對藍色光照特別敏感。當(dāng)它受到藍光照射時，會吸收藍光的部分能量，發(fā)射出綠色的熒光。基于這一性質(zhì)，GFP 可以用來標(biāo)記幾乎任何生物分子或細(xì)胞，因此GFP 已成為一個在完整細(xì)胞膜內(nèi)或組織內(nèi)監(jiān)測基因表達和蛋白定位的理想標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于多種生物體。近年來，隨著研究的深入發(fā)展，唑酮類化合物被廣泛應(yīng)用于制備光控傳感器，檢測酸堿度、重金屬離子及特殊化學(xué)物質(zhì)（如糖類）等[9-10]。

唑酮類化合物可以由芳醛和α-?；拾彼嵩谝宜狒痛姿徕c（或碳酸鉀）的作用下通過Erlenmeyer-Plochl 反應(yīng)制得，反應(yīng)式如圖2 所示[11]。

圖2 芳醛與α-?；拾彼峥s合制備唑酮

由于取代基結(jié)構(gòu)會影響熒光物質(zhì)的熒光特征和強度，如給電子基能增大共軛體系從而導(dǎo)致熒光增強，而吸電子基使熒光減弱。因此，當(dāng)取代基R1和R2不同的芳醛和α-?；拾彼醿蓛山M合時，可反應(yīng)得到不同熒光性質(zhì)的發(fā)色團類似物。

2 實驗方案

2.1 試劑與儀器

反應(yīng)物芳醛和α-?；拾彼幔?9%，上海阿達瑪斯試劑有限公司）如表1 所示。

表1 α-酰基甘氨酸和芳醛

試劑乙酸酐、乙酸鈉、無水乙醇（分析純，成都科龍化工試劑廠）；ZF-7 三用紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限公司）；Bruker AVANCE III 400 核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司）；SGW X-4A 顯微熔點儀（上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司）；Hitachi F-7000 熒光分光光度計（日本日立公司）。

2.2 特定發(fā)色團化合物A1 的合成

首先使4-甲氧基苯甲醛（反應(yīng)物A，R1=OCH3）與馬尿酸（反應(yīng)物1，R2=）反應(yīng)，生成發(fā)色團化合物 A1：2-苯基-4-（4-甲氧基苯亞甲基）-5-噁唑酮（4-(4-methoxylbenzylidene)-2-phenyloxazol-5-one）。具體步驟為：將4-甲氧基苯甲醛（0.5 mL，4 mmol）、馬尿酸（0.72 g，4 mmol）、乙酸鈉（0.33 g，4 mmol）、乙酸酐（1.5 mL，16 mmol）一起加入100 mL 圓底燒瓶中，加熱溶解，磁力攪拌下140 ℃左右回流反應(yīng)2 h。冷卻至室溫后，用60 mL 乙醇分3 次洗滌產(chǎn)物，抽濾，收集濾餅，避光干燥，得亮黃色固體。計算粗產(chǎn)品產(chǎn)率。

2.3 檢測熒光顏色

取少量化合物A1 固體置于濾紙上，在365 nm 波長紫外光照射下觀察化合物的熒光顏色。

2.4 自由選擇反應(yīng)底物，探索產(chǎn)物熒光性質(zhì)

學(xué)生自主選取芳醛（A 或B）和α-?；拾彼幔?或2），兩兩組合，采用與2.1 節(jié)中相同條件，進一步合成至少一種不同結(jié)構(gòu)的唑酮化合物（A2 或B1 或B2）。反應(yīng)時間縮短至10 min 左右反應(yīng)瓶內(nèi)出現(xiàn)顏色即可停止反應(yīng)[12]。取少量有色化合物在365 nm 波長紫外光下觀察并比較不同結(jié)構(gòu)噁唑酮化合物的熒光顏色與強弱。

2.5 產(chǎn)物性質(zhì)檢測

核磁表征：用核磁共振氫譜儀對制備的A1 結(jié)構(gòu)進行核磁質(zhì)譜（1H NMR）表征。以氘代氯仿（CDCl3）為溶劑，以四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

熔點測定：用熔點儀測定A1 的熔點。

熒光光譜測試：采用熒光分光光度計（λex=450 nm）檢測固體樣品的發(fā)光光譜。

3 實驗設(shè)計與教學(xué)實施特色

3.1 實驗符合綠色化學(xué)理念

（1）實驗選取的反應(yīng)原料無毒或低毒，大多可來源于天然產(chǎn)物。如4-甲氧基苯甲醛又名茴香醛，在自然界中存在于茴香油、小茴香油等物質(zhì)中，可經(jīng)氧化分離提取得到。苯甲醛廣泛存在于植物中，特別是薔薇科植物；此外苯甲醛還天然存在于苦杏仁油、藿香油、風(fēng)信子油、依蘭油等精油中。N-苯?；拾彼嵊置R尿酸，是生物體代謝產(chǎn)物，存在于馬、人類的尿液中。

（2）在反應(yīng)過程中使用反應(yīng)物乙酸酐為溶劑，在乙酸酐沸點的溫度（139 ℃）左右反應(yīng)回流，避免了溶劑使用帶來的污染與危害。

3.2 實驗直觀生動，寓教于樂

反應(yīng)底物均為白色或無色，隨著反應(yīng)的進行，學(xué)生在幾分鐘到十幾分鐘之內(nèi)即可觀察到黃色或綠色產(chǎn)物；當(dāng)停止反應(yīng)取少量產(chǎn)物置于365 nm 紫外燈下時，又可觀察到比自然光下更加鮮艷明亮的熒光色（見圖3）。

圖3 A1 化合物在自然光照和紫外光照下的顏色

生動鮮明的實驗現(xiàn)象使實驗本身充滿了吸引力，學(xué)生通過化學(xué)實驗創(chuàng)造具有美感的化學(xué)作品、感受樂趣的同時，也學(xué)習(xí)到了化學(xué)實驗的基本知識、鍛煉了動手操作能力。這樣的教學(xué)過程既遵從了青年學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律，也保留了化學(xué)以實驗為基礎(chǔ)的學(xué)科特點，表現(xiàn)出了傳統(tǒng)化學(xué)實驗教學(xué)不可比擬的優(yōu)勢。

圖4 4 種噁唑酮化合物顏色及結(jié)構(gòu)

3.3 以興趣為主導(dǎo)培養(yǎng)研究探索能力

在實驗教學(xué)中，學(xué)生是活動的中心和主題，興趣是學(xué)生主動參與的前提條件[13]。因此，實驗過程中生動直觀的現(xiàn)象引起了學(xué)生強烈的好奇心，進一步激發(fā)了他們探索現(xiàn)象背后原理的欲望。因此，課程設(shè)置了“自主選擇反應(yīng)底物合成一系列不同結(jié)構(gòu)的唑酮類熒光發(fā)色團，并比較相應(yīng)產(chǎn)物熒光性質(zhì)的差異”這一開放性內(nèi)容，以培養(yǎng)學(xué)生的研究探索能力。

學(xué)生用不同的芳醛和α-?；拾彼醿蓛山M合，得到了4 種具有不同熒光顏色和強度的噁唑酮化合物，如圖4 所示。因此進一步要求學(xué)生針對不同結(jié)構(gòu)化合物具有不同熒光性質(zhì)這一現(xiàn)象，討論“共軛體系大小”“取代基R1和R2給電子或吸電子能力差異等”因素對化合物熒光性質(zhì)的影響。學(xué)生將具體的實驗現(xiàn)象與理論機理相結(jié)合，解釋了4 種化合物熒光強弱的變化規(guī)律：A1 化合物同時含有可增大離域體系的苯基（R2）以及強給電子的甲氧基（R1）；A2 和B1 只具有苯基或甲氧基其中一個基團；而B2 中2 個基團都不具備，因此4 種化合物的熒光強弱遵循A1＞A2＞B1＞B2 的規(guī)律[14]。

3.4 針對不同知識背景不同層級學(xué)生分層次教學(xué)

（1）入門層次：由于噁唑酮的合成條件簡單易行、試劑安全無污染，因此即使是非化學(xué)相關(guān)專業(yè)本科學(xué)生（如文科生）在經(jīng)過簡單基礎(chǔ)知識學(xué)習(xí)與實驗安全培訓(xùn)后，也能順利完成制備實驗；并且學(xué)生們還可以通過觀察發(fā)現(xiàn)實驗中有趣現(xiàn)象的發(fā)生，獲得對化學(xué)反應(yīng)的直觀了解，加深對化學(xué)的認(rèn)知，從而豐富自身多學(xué)科的視野。

（2）基礎(chǔ)層次：對于化學(xué)或化學(xué)相關(guān)專業(yè)理工科本科生，在教學(xué)中要求學(xué)生掌握實驗背景與反應(yīng)機理；在完成特定化合物合成的同時規(guī)范實驗技能；對產(chǎn)物的理化性質(zhì)進行檢測，如1H NMR 結(jié)構(gòu)表征、熔點測定等，從而鞏固學(xué)生的化學(xué)理論基礎(chǔ)，提升學(xué)生的實驗技能。

（3）提升層次：對于學(xué)有余力并有極高研究熱情的同學(xué)，可以引導(dǎo)他們深入探究取代基結(jié)構(gòu)對噁唑酮熒光性能的影響，以實驗促進理論知識的掌握；在第一層次直觀觀察熒光顏色的基礎(chǔ)上，進一步用熒光光譜儀對產(chǎn)物進行測試和比較，探究化合物結(jié)構(gòu)對其熒光效率的影響；還可以引入計算化學(xué)相關(guān)知識，計算化合物HOMO-LUMO 能帶，從結(jié)構(gòu)預(yù)測熒光顏色等，從而使學(xué)生更深刻體會化學(xué)基本原理，激發(fā)他們對化學(xué)的興趣。

4 結(jié)語

本文設(shè)計的“綠色熒光蛋白質(zhì)發(fā)色團的合成”實驗，在教學(xué)過程中抓住青年學(xué)生對事物具有強烈好奇心和敏銳觀察力的特點，使他們產(chǎn)生探究實驗現(xiàn)象背后原因的興趣；學(xué)生在操作、改進和探索趣味實驗的同時，強化了對理論知識及規(guī)律的理解。遵循從“廣而博”到“少而精”的教育規(guī)律，通過層次分明、循序漸進的化學(xué)實驗課程訓(xùn)練，充分鍛煉了學(xué)生的動手能力，促進了自主學(xué)習(xí)能力的提高，培養(yǎng)了實事求是的科學(xué)態(tài)度，發(fā)掘了敢于質(zhì)疑、勇于創(chuàng)新的科學(xué)精神，為學(xué)生將來成為具有良好科學(xué)素養(yǎng)的創(chuàng)新型人才奠定了基礎(chǔ)。