王凱 汪毅 曲愛(ài)愛(ài) 王蕊 郭海林 李曉慧 佘建明 宗俊勤 李建建 劉建秀

摘? 要：為構(gòu)建有效的溝葉結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系，以溝葉結(jié)縷草愈傷組織為受體材料，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將筆者單位克隆的耐鹽相關(guān)基因ZmPDI基因轉(zhuǎn)入野生型植株中，研究共培養(yǎng)時(shí)間、侵染液濃度、侵染時(shí)間和抗生素濃度等因子對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明：最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系為菌株OD600值為0.4，侵染30 min，共培養(yǎng)3 d后進(jìn)行選擇培養(yǎng)。特美汀在選擇培養(yǎng)階段最適抑菌濃度為250 mg/L，潮霉素愈傷組織篩選的最適選擇壓力為40 mg/L，苗篩的最適濃度為15 mg/L。通過(guò)GUS活性的組織化學(xué)分析和PCR鑒定，顯示目的基因已成功轉(zhuǎn)入溝葉結(jié)縷草基因組中。

關(guān)鍵詞：溝葉結(jié)縷草;蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）;根癌農(nóng)桿菌;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S688.4? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Zoysia matrella is a perennial warm-season turfgrass， one of halophytes with the salt-tolerantce， and is widely used in temperate zone and subtropical regions. However， its complete genetic transformation system have not been reported. In this study， the callus from Z. matrella was used as receptor material and the genetic transformation of the salt-tolerant gene ZmPDI was carried out by Agrobacterium-mediated method to study a series of conditions for transformation efficiency including the co-culture time， concentration of the infection， and infection time. The results showed that the optimal genetic transformation was supposed to be： agrobacterium concentration OD600 = 0.4， infected for 30 minutes， co-cultured for 3 days and then followed by selective culture. During the whole process， the optimum concentration of timentin in the postponed culture medium was 250 mg/L. As for hygromycin， the optimal selection pressure for callus was 40 mg/L， while the best concentration for rooting screening was 15 mg/L. The histochemical analysis of β-glucuronidase （GUS） activities and PCR identification indicated that the ZmPDI gene was transferred into the genome by hygromycin resistance selection.

Keywords： Zoysia matrella; PDI; Agrobacterium tumefaciens; genetic transformation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.009

溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）是禾本科（Gramineae）畫(huà)眉草亞科（Choridoideae）結(jié)縷草屬的多年生暖季型草坪草，同時(shí)也是鹽生植物，廣泛分布于溫帶亞熱帶。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成熟，可以對(duì)特定的靶基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以縮短育種周期。在植物轉(zhuǎn)基因方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法因其高轉(zhuǎn)化效率，易于使用和低成本而成為優(yōu)選的方法。迄今為止，這種方法在結(jié)縷草屬中也已經(jīng)成功。據(jù)報(bào)道，Kang等[1]將Zjchi2基因?qū)虢Y(jié)縷草胚性愈傷組織中，得到了轉(zhuǎn)基因植株;馬彩云[2]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將DREB基因轉(zhuǎn)入青島結(jié)縷草;代小梅[3]將ZjGA20ox基因轉(zhuǎn)入日本結(jié)縷草;Li等[4]將CBF1基因轉(zhuǎn)入中華結(jié)縷草。然而，目前，有關(guān)溝葉結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化的研究報(bào)道極少，僅見(jiàn)于溝葉結(jié)縷草抗草甘膦遺傳轉(zhuǎn)化初步研究中，以溝葉結(jié)縷草愈傷組織為試驗(yàn)材料，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，在含有2、3、5 mmol/L草甘膦的篩選培養(yǎng)基上各4周，再生16周，共得到54粒愈傷組織出現(xiàn)綠色小苗，但其再生苗尚未鑒定，所以遺傳轉(zhuǎn)化體系并不完整[5]。

蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disufide isomerase，PDI）屬硫氧還蛋白亞家族成員，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一種重要的折疊催化劑，能通過(guò)氧化活性（催化蛋白形成二硫鍵）和異構(gòu)酶活性（催化錯(cuò)誤配對(duì)二硫鍵的重排）來(lái)改變蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)蛋白的正確折疊[6]。研究發(fā)現(xiàn)水稻中PDI基因的功能缺失表現(xiàn)出粉狀胚乳的特征[7-8];在擬南芥中PDI家族一個(gè)成員AtPDI6突變能夠誘導(dǎo)葉綠體中D1蛋白的合成，從而緩解了強(qiáng)光脅迫下的光抑制現(xiàn)象[9]。然而，在結(jié)縷草中關(guān)于PDI的研究很少。僅在本單位的前期工作中，使用鹽脅迫處理下的溝葉結(jié)縷草作為材料構(gòu)建了全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(kù)，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后經(jīng)耐鹽篩選獲得了一個(gè)編碼蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因ZmPDI（NCBI登錄號(hào)：KM265179）。鹽脅迫下溝葉結(jié)縷草中ZmPDI的表達(dá)顯著上調(diào)[10]。ZmPDI基因如何調(diào)控溝葉結(jié)縷草耐鹽性，其機(jī)制尚不清楚。

為了闡明ZmPDI基因?qū)先~結(jié)縷草耐鹽性的分子調(diào)控機(jī)制，本研究以溝葉結(jié)縷草愈傷組織為外植體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ZmPDI基因?qū)霚先~結(jié)縷草基因組中，探究菌株濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的溝葉結(jié)縷草轉(zhuǎn)基因效率的影響，以期建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的溝葉結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系，為溝葉結(jié)縷草的包括ZmPDI基因在內(nèi)的基因功能和分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料與載體菌株? 植物材料為溝葉結(jié)縷草匍匐莖誘導(dǎo)的愈傷組織，根癌農(nóng)桿菌為EHA105（Agrobacterium tumefaciens），載體質(zhì)粒為pCAMBIA1305.2（含GUS報(bào)告基因及潮霉素Hyg篩選標(biāo)記）。

1.1.2? 生化試劑及酶? 預(yù)混型DNA聚合酶Premix Taq? Version 2.0（TaKaRa公司）;DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA adder Marker（TaKaRa公司）;質(zhì)粒提取試劑盒AxyPrepTM Pasmid Miniprep Kit（天根生化科技有限公司）;新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）;特美汀Timentin、卡那霉素Kan、利福平Rif、潮霉素Hyg、乙酰丁香酮（AS）（北京索萊寶科技有限公司）;GUS染色試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）;引物合成及測(cè)序均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成;常規(guī)化學(xué)藥品及試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)分析純。

1.1.3? 培養(yǎng)基的配制? 試驗(yàn)用基本培養(yǎng)基成分見(jiàn)表1。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗(yàn)材料誘導(dǎo)、繼代和預(yù)培養(yǎng)? 由溝葉結(jié)縷草匍匐莖誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，其誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)參照Chai等[11]的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化前，材料在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)1周。

1.2.2? 抑菌劑濃度和抗生素篩選壓的確定? 抑菌劑特美?。═imentin）濃度確定：參照Z(yǔ)hang等[12]的方法并加以調(diào)整，將經(jīng)農(nóng)桿菌菌株侵染30 min的愈傷組織，分別放置于含Timentin的愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，設(shè)6個(gè)試驗(yàn)梯度，分別為0、100、150、200、250、300 mg/L，每梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，30 d后記錄數(shù)據(jù)，確定最佳抑菌劑濃度。

潮霉素（Hyg）篩選濃度的確定：參照Wu等[13]的方法并加以調(diào)整，首先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，將溝葉結(jié)縷草愈傷組織放置于繼代培養(yǎng)基（含Hyg）上生長(zhǎng)，設(shè)5個(gè)試驗(yàn)梯度0、20、30、40、50 mg/L，處理25 d后移至分化培養(yǎng)基，30 d后記錄數(shù)據(jù)，確定愈傷組織初篩濃度。將分化苗放置于生根培養(yǎng)基（含Hyg），設(shè)5個(gè)試驗(yàn)梯度0、5、10、15、20 mg/L，20 d后記錄數(shù)據(jù)，確定分化苗初篩濃度。接下來(lái)對(duì)經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的溝葉結(jié)縷草愈傷組織進(jìn)行上述操作（培養(yǎng)基均含有Timentin），確定潮霉素最佳篩選濃度。

統(tǒng)計(jì)外植體分化率和成苗率，以上每梯度重復(fù)3次。

分化率=完成分化愈傷組織數(shù)/總愈傷組織數(shù)× 100%;成苗率=分化苗數(shù)/總苗數(shù)×100%。

1.2.3? 轉(zhuǎn)化條件的探索? 探索最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件時(shí)，參照代小梅[3]的方法并加以調(diào)整。

菌株濃度的確定：浸染外植體時(shí)，菌株濃度（OD600）分別是0.2、0.4、0.6、0.8。

菌株侵染時(shí)間的選擇：浸染外植體時(shí)，侵染時(shí)間為10、20、30、40 min。

共培養(yǎng)時(shí)間的確定：浸染外植體時(shí)，共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為1、2、3、4 d。

根據(jù)GUS活性的組織化學(xué)分析結(jié)果記錄藍(lán)色愈傷組織數(shù)，每梯度重復(fù)3次。

轉(zhuǎn)化率=GUS染色藍(lán)色愈傷組織數(shù)/愈傷組織總數(shù)×100%

1.2.4? 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的溝葉結(jié)縷草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化? 將放置于80 ℃的菌株（含有50%甘油）在室溫下解凍后[14]，在YEP固體培養(yǎng)基（含50 mg/L Kana和50 mg/L Rif）劃板培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28 ℃，48 h，挑取單克隆接種于5 mL YEP+ 50 mg/L Kana+50 mg/L Rif液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，200～220 r/min震蕩20～24 h，取上述培養(yǎng)的菌株800～1000 μL，加入到25 mL含YEP+50 mg/L Kana+50 mg/L Rif液體培養(yǎng)基中，28 ℃，220 r/min培養(yǎng)5～6 h，待菌株OD600為0.5左右時(shí)，取25 mL放入50 mL管中，室溫下4000 r/min，離心10 min。棄上清，再向離心管加入侵染液將菌株調(diào)至OD600為0.4（約109個(gè)/ mL），加入100 μmol/mL AS用于侵染。

參考張麗[5]、張芳等[15]的方法，對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程加以改進(jìn)。將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織放置于菌液（菌株OD600為0.4）浸染30 min，（25±2）℃，暗處理3 d。共培養(yǎng)后先轉(zhuǎn)入含250 mg/L Timentin和40 mg/L Hyg篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d。之后在光照條件下轉(zhuǎn)入含250 mg/L Timentin分化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。切取長(zhǎng)至3 cm左右的幼苗，轉(zhuǎn)入含250 mg/L Timentin和15 mg/L Hyg苗篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d，將得到抗性苗經(jīng)煉苗栽入花盆移至戶(hù)外生長(zhǎng)（以上培養(yǎng)基見(jiàn)表1）。

1.2.5? 抗性植株的PCR檢測(cè)和GUS活性分析? 取抗性苗及未轉(zhuǎn)化再生苗的葉片，使用DNA快速提取試劑盒提取植株葉片DNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增HPT基因，序列為：HPT-F：5-GAAAAAGCCT GAACTCACCGC-3;HPT-R：5-TGCTCCATAC AAGCCAACCAC-3;預(yù)期片段大小為729 bp。模板是轉(zhuǎn)化苗葉片DNA，陽(yáng)性對(duì)照是質(zhì)粒PcamBIA1305.2，陰性對(duì)照是正常再生苗葉片DNA。擴(kuò)增體系為：12.5 μL Premix Taq，1 μL DNA模板，HPT-F和HPT-R（20 μmol/L）各1 μL，去離子水補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

取侵染后的愈傷組織放入配好的GUS染色工作液中，用錫箔紙包裹，在37 ℃孵育24 h，用70%乙醇脫色6 h，在顯微鏡下觀察愈傷組織著色情況。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行處理，采用SPSS軟件（v22.0）進(jìn)行方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 轉(zhuǎn)化條件對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

從圖1A可以看出，外植體的轉(zhuǎn)化效率隨著農(nóng)桿菌株濃度的增加表現(xiàn)出先升后降的情況。當(dāng)OD600為0.4時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到頂峰，為56%;當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí)，轉(zhuǎn)化效率均低于50%，這是因?yàn)檗r(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)大量褐化死亡，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低。所以，選用OD600為0.4作為侵染液菌株最適濃度。

從圖1B可以看出，轉(zhuǎn)化效率隨著菌株浸染時(shí)間的增加表現(xiàn)出先升后降的現(xiàn)象。當(dāng)浸染時(shí)間為30 min時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到峰值，為83.7%，是浸染10 min時(shí)的3.3倍;而浸染40 min時(shí)的轉(zhuǎn)化效率不及30 min時(shí)的四分之一，這可能是菌株過(guò)多包裹于材料上，導(dǎo)致愈傷組織不能生長(zhǎng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化率下降。所以，最佳的農(nóng)桿菌浸染時(shí)間選擇為30 min。

的增加表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，轉(zhuǎn)化效率為70%，達(dá)到最高;而4 d時(shí)的轉(zhuǎn)化效率僅為3 d時(shí)的一半，這可能是菌株量過(guò)多，對(duì)受體材料存在嚴(yán)重?fù)p害，從而影響后期愈傷組織生長(zhǎng)。所以，最佳的共培養(yǎng)時(shí)間選擇為3 d。

2.2? 特美汀抑菌濃度的確定

如圖2所示，隨著抑菌劑Timentin濃度的增加，其抑菌表現(xiàn)力變得越來(lái)越明顯。盡管300 mg/L Timentin能抑制全部菌株生長(zhǎng)，但此時(shí)的愈傷分化率還沒(méi)有250 mg/L Timentin的一半;而200 mg/L Timentin雖有59.7%的愈傷分化率，但其抑菌效果不佳。為了達(dá)到既有效控制菌株的快速增殖又不降低愈傷分化率，因此選用250 mg/L Timentin抑制菌株大規(guī)模繁殖。

2.3? 潮霉素篩選濃度的確定

由圖3可見(jiàn)，無(wú)論轉(zhuǎn)化材料是否經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染，隨著潮霉素濃度的升高，其成苗率及分化苗的存活率均逐步下降。當(dāng)濃度分別為50 mg/L（圖3A、圖3C）和20 mg/L（圖3B、圖3D）時(shí)，觀察到經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染的材料出現(xiàn)大面積褐化及其分化苗枯死情況，這說(shuō)明它的分化過(guò)程與幼苗生長(zhǎng)過(guò)程均受到嚴(yán)重抑制。而濃度分別為40 mg/L和15 mg/L時(shí)，其成苗率為6.3%，幼苗存活率為6.3%。這既能篩選掉絕大部分假陽(yáng)性材料，又保證有一定的存活率。因此在愈傷階段選擇40 mg/L Hyg，在苗篩階段選擇15 mg/L Hyg。

2.4? 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2.4.1? 轉(zhuǎn)化材料GUS檢測(cè)? 根據(jù)上述轉(zhuǎn)化方法，經(jīng)歷從最開(kāi)始預(yù)處理的外植體到最終出現(xiàn)陽(yáng)性苗的過(guò)程，獲得可能的轉(zhuǎn)基因植株（圖4）。對(duì)不同過(guò)程的材料使用GUS活性的組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株侵染的愈傷組織和兩次篩選得到的陽(yáng)性苗在GUS染色后呈藍(lán)色（圖5），說(shuō)明GUS基因已成功在愈傷組織、植株和葉片中穩(wěn)定表達(dá)。

2.4.2? 轉(zhuǎn)化材料PCR檢測(cè)? 對(duì)轉(zhuǎn)化后的再生苗進(jìn)行分子水平上的PCR檢測(cè)。從18株再生苗中隨機(jī)選擇5株，提取其葉片DNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)看是否可以擴(kuò)增出HPT基因。結(jié)果表明，5株均能擴(kuò)增出729 bp的目的片段（圖6），而野生型對(duì)照組（-）則未能擴(kuò)增出目的條帶。這結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明目的基因已成功地整合到溝葉結(jié)縷草的基因組中。

3? 討論與結(jié)論

當(dāng)前，利用農(nóng)桿菌作為媒介進(jìn)行轉(zhuǎn)基因是構(gòu)建草坪草轉(zhuǎn)化體系的常用手段，并已在海濱雀稗（Paspalum vaginatum）[13]、黑麥草（Lolium perenne）[14]、假儉草（Eremochloa ophiuroides）[15]、匍匐剪股穎（Agrostis stolonifera）[16]、早熟禾（Poa annua）[17]、日本結(jié)縷草（Zoysia japonica）[18]、中華結(jié)縷草（Zoysia sinica Hance）[19]和細(xì)葉結(jié)縷草（Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin.）[20]等草坪植物中獲得成功。溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）是鹽生植物，廣泛分布于溫帶亞熱帶。然而，其遺傳轉(zhuǎn)化體系鮮見(jiàn)研究，嚴(yán)重影響了其優(yōu)異基因發(fā)掘和分子育種研究，因此建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)迫在眉睫。本試驗(yàn)以溝葉結(jié)縷草匍匐莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織作為試驗(yàn)材料，報(bào)告基因?yàn)镚US基因，第一次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將本單位克隆的耐鹽相關(guān)基因ZmPDI基因轉(zhuǎn)入野生型植株中，探索適合溝葉結(jié)縷草轉(zhuǎn)化的條件，經(jīng)潮霉素篩選后得到的抗性苗，通過(guò)PCR檢測(cè)和GUS活性的組織化學(xué)分析表明其為陽(yáng)性。這為溝葉結(jié)縷草的基因轉(zhuǎn)化奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，同時(shí)也為其在分子育種方面提供了新思路。

3.1? 轉(zhuǎn)化條件的選擇

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程是極為精密而繁瑣的，多種因素決定其轉(zhuǎn)化能否成功，包括菌株濃度的高低、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短等，從而導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化率上存在很大差異。在草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化中菌株濃度選擇范圍、侵染時(shí)間段和共培養(yǎng)用時(shí)范圍均有所區(qū)別，其中結(jié)縷草中為OD600= 0.4～0.6，15～30 min，2～4 d[18， 21];黑麥草中為OD650= 0.8，20 min，3 d[13， 22];早熟禾中為OD650=0.6，9 min，2～4 d[12]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，工作菌濃度OD600為0.4，菌株侵染30 min，3 d共培養(yǎng)是最適合溝葉結(jié)縷草的。菌液工作濃度過(guò)高過(guò)低都導(dǎo)致侵染失效，侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)愈傷組織形成永久性損傷引發(fā)褐化現(xiàn)象，也會(huì)增加抑菌的難度。過(guò)短導(dǎo)致侵染效果不佳，出現(xiàn)大量假陽(yáng)性再生苗進(jìn)而延長(zhǎng)試驗(yàn)周期。

3.2? 抑菌劑（Timentin）濃度的確定

為了達(dá)到既保證菌株可以有效侵染轉(zhuǎn)化材料，又要防止菌株過(guò)快增殖導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗的目的，因此抑菌劑的種類(lèi)也是決定轉(zhuǎn)化能否成功的重要因素之一。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草坪草植物轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，抑菌劑選擇范圍包括頭孢霉素、羧芐青霉素和特美汀三類(lèi)，在結(jié)縷草和匍匐剪股穎遺傳轉(zhuǎn)化研究中頭孢霉素選擇300～500 mg/L[1-3， 23];在假儉草中頭孢霉素選擇200～400 mg/L[15， 24];在結(jié)縷草中羧芐青霉素選擇250～1000 mg/L[18];在結(jié)縷草和黑麥草中特美汀選擇200 mg/L[5， 12]，本試驗(yàn)對(duì)比抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)特美汀比頭孢霉素效果明顯，雖然使用500 mg/L Cef在愈傷組織篩選階段能有效抑制菌株繁殖，但再生階段時(shí)常發(fā)現(xiàn)菌株出現(xiàn)爆發(fā)式生長(zhǎng)。而250 mg/L Timentin即能控制其快速生長(zhǎng)，同時(shí)也能保證轉(zhuǎn)化材料的正常分化。因此選用250 mg/L Timentin抑制菌株過(guò)度增殖。

3.3? 篩選劑潮霉素濃度的確定

潮霉素是禾本科植物中以農(nóng)桿菌作為媒介進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化常用的篩選劑之一，潮霉素濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的順利實(shí)施，在已報(bào)道的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化研究中，采用潮霉素濃度選擇25～80 mg/L[12， 14];在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化研究中，篩選濃度在愈傷組織生長(zhǎng)期間多選擇45～75 mg/L，在再生苗生長(zhǎng)階段選擇20 mg/L[18， 21]。本試驗(yàn)分別在愈傷分化期和再生苗生長(zhǎng)期進(jìn)行潮霉素梯度試驗(yàn)（用量范圍為0～50 mg/L），發(fā)現(xiàn)不管轉(zhuǎn)化材料是否經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染，隨著濃度用量不斷加大，其分化率及分化苗的存活率均逐步下降。在預(yù)試驗(yàn)中隨著用量不斷加大，愈傷分化率從73%下降至3.6%;再生苗的成苗率從81.7%降至5.3%;而經(jīng)農(nóng)桿菌侵染過(guò)的愈傷組織的分化率及其再生苗的成苗率下降更加明顯，分別從57%降至0%和從66.7%降至0.3%。這其中當(dāng)濃度分別為50 mg/L和20 mg/L時(shí)，觀察到經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織出現(xiàn)大面積褐化情況及其分化苗因超負(fù)荷篩選而枯死，這說(shuō)明它的分化過(guò)程與幼苗生長(zhǎng)過(guò)程均受到嚴(yán)重抑制。而濃度選擇40 mg/L和15 mg/L時(shí)，其成苗率為6.3%，幼苗存活率為6.3%。這既能篩選掉絕大部分假陽(yáng)性材料，又保證有一定的存活率。因此對(duì)于潮霉素采用間隔性二篩法，其中在愈傷階段選擇40 mg/L Hyg，在苗篩階段選擇15 mg/L Hyg。

參考文獻(xiàn)

Kang J N， Park M Y， Kim W N， et al. Resistance of transgenic zoysiagrass overexpressing the zoysiagrass class II chitinase gene Zjchi2 against Rhizoctonia solani AG2-2 （IV） [J]. Plant Biotechnology Reports， 2017， 11（4）： 229-238.

馬彩云. 結(jié)縷草組織培養(yǎng)再生體系建立及轉(zhuǎn)BdDREB2基因的研究[D]. 阿拉爾： 塔里木大學(xué)， 2010.

代小梅. 日本結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）ZjGA20ox基因表達(dá)模式及RNA干擾載體遺傳轉(zhuǎn)化體系研究[D]. 北京： 北京林業(yè)大學(xué)， 2013.

Li R F， Wei J H， Wang H Z， et al. Development of highly regenerable callus lines and Agrobacterium-mediated transformation of Chinese lawn grass （Zoysia sinica Hance） with a cold inducible transcription factor， CBF1[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2006， 85（3）： 297-305.

張? 麗. 溝葉結(jié)縷草抗稀禾定體細(xì)胞無(wú)性系變異篩選和抗草甘膦遺傳轉(zhuǎn)化初步研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2013.

劉光快， 曹珍珍， 韋克蘇， 等. 水稻蛋白二硫鍵異構(gòu)酶基因沉默載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因后代的高溫結(jié)實(shí)特性分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2013， 39（5）： 816-826.

Han X H， Wang Y H， Liu X， et al. The failure to express a protein disulphide isomerase-like protein results in a floury endosperm and an endoplasmic reticulum stress response in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（1）： 121-130.

Zhu C， Luo N， He M， et al. Molecular characterization and expression profiling of the protein disulfide isomerase gene family in Brachypodium distachyon L.[J]. PLoS One， 2014， 9（4）： e94704.

Wittenberg G， Levitan A， Klein T， et al. Knockdown of the Arabidopsis thaliana chloroplast protein disulfide isomerase 6 results in reduced levels of photoinhibition and increased D1 synthesis in high light[J]. The Plant Journal， 2014， 78（6）： 1003-1013.

Chen Y， Zong J Q， Tan Z Q， et al. Systematic mining of salt-tolerant genes in halophyte-Zoysia matrella through cDNA expression library screening[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2015， 89： 44-52.

Chai M L， Jia Y F， Chen S， et al. Callus induction plant regeneration and long-term maintenance of embryogenic cultures in Zoysia matrella （L.） Merr[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2011， 104（2）： 187-192.

Zhang K W， Wang J， Hu X R， et al. Agrobacterium- mediated transformation of shoot apices of Kentucky bluegrass （Poa pratensis L.） and production of transgenic plants carrying abetA gene[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2010， 102（2）： 135-143.

Wu X L， Shi H F， Chen X W， et al. Establishment of Agrobacterium-mediated transformation of seashore paspalum （Paspalum vaginatum O. Swartz）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant， 2018， 54（5）： 545-552.

Esmaeili S， Salehi H， Khosh K M， et al. Isopentenyl transferase （IPT） gene transfer to perennial ryegrass through sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation （SAAT）， vacuum and heat treatment[J]. Molecular Biotechnology， 2019， 61（5）： 332-344.

張? 芳， 王? 舟， 宗俊勤， 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的假儉草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 20（2）： 184-192.

安惠惠， 馬暉玲， 李? 堅(jiān)， 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Lyz-GFP基因?qū)橘媵骞煞fPenn A-1轉(zhuǎn)化和表達(dá)的研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2012， 21（2）： 141-148.

任玉靜， 甘? 露， 蘇浩天， 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草地早熟禾轉(zhuǎn)基因的研究[C]//2018中國(guó)草學(xué)會(huì)年會(huì)論文集， 2018： 470-474.

劉? 莉. 日本結(jié)縷草IPT基因遺傳轉(zhuǎn)化及野牛草實(shí)生群體內(nèi)遺傳多樣性研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

Lei J L， Wang D， Wu Y M， et al. Establishment of genetic transformation system of Chinese zoysia （Zoysia sinica） mediated by Agrobacterium tumefaciens soaked seeds[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2009（5）： 865-871.

Li M R， Li H Q， Hu X Y， et al. An Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation system using callus of Zoysia tenuifolia Willd. ex Trin [J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2010， 102（3）： 321-327.

Ge Y X， Norton T， Wang Z Y， Transgenic zoysiagrass （Zoysia japonica） plants obtained by Agrobacterium- medi ated transformation[J]. Plant Cell Reports， 2006， 25（8）： 792-798.

Bales， Carmille J C. Agrobacterium-mediated transformation of perennial ryegrass （Lolium perenne L.） for cold tolerance[J]. Masters Abstracts International， 2010（49）： 67.

Han Y J， Kim Y M， Lee J Y， et al. Production of purple-colored creeping bentgrass using maize transcription factor genes Pl and Lc through Agrobacterium-mediated transformation[J]. Plant Cell Reports， 2009， 28（3）： 397-406.

Liu M X， Lu S Y， Liu L， et al. Agrobacterium-mediated transformation of centipede grass （Eremochloa ophiuroides [Munro] Hack.）[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2012， 109（3）： 557-563.