祝曉玲, 劉淑梅, 楊愛華, 陶安福

1天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院婦產(chǎn)科(天津 300467)； 2天津海濱人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(天津 300450)； 3國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心、天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗科(天津 300060)

宮腔粘連(IUAs)，也稱為Asherman綜合征，其特征在于子宮或子宮頸內(nèi)的瘢痕組織的發(fā)展，并導(dǎo)致子宮內(nèi)膜表面部分或完全發(fā)生黏附[1]。宮腔粘連最常見的原因是子宮手術(shù)，其主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)過少、閉經(jīng)、周期性腹痛、異常妊娠或繼發(fā)性不孕等[2-3]。宮腔粘連一旦出現(xiàn)并發(fā)展起來，其對各種療法都產(chǎn)生或多或少的抵抗力，并且許多患者的預(yù)后很差?；加袑m腔粘連的育齡婦女即使經(jīng)過長期治療，仍可能會出現(xiàn)不孕或反復(fù)流產(chǎn)的情況，而且很大部分的宮腔粘連患者在后期極易發(fā)展成為宮頸癌，嚴(yán)重影響女性的生理健康[4]。雖然人們普遍認(rèn)為這種疾病是由子宮內(nèi)膜基底層引起的損傷造成的，但是，目前還是有許多關(guān)于宮腔粘連發(fā)病機(jī)制的假設(shè)，包括纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積和纖維結(jié)締組織增生，纖維化等[5]。宮腔粘連發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制還不太明確。最近，許多miRNA已確定在多種類型的細(xì)胞中對纖維化的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用，包括肝、腎、心臟、宮腔和口腔黏液組織等[6-8]。最近的研究報道m(xù)iR-29b通過TGF-β1/ Smad上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑在子宮內(nèi)膜粘連中起到重要的調(diào)節(jié)功能[9]。miR-1291作用于ArhGAP29的上游并負(fù)性調(diào)節(jié)RhoA/ROCK1通路來促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜粘連的發(fā)生[10]。miR-326通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路抑制子宮內(nèi)膜纖維化，提示miR-326可能是宮腔粘連的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點[11]。但是，國內(nèi)外目前還沒有關(guān)于miR-665在宮腔粘連中作用機(jī)制的報道。本研究旨在探討miR-665在宮腔粘連及宮頸癌患者中表達(dá)水平及作用機(jī)制，以期為宮腔粘連及宮頸癌患者的早期預(yù)防、精準(zhǔn)診療提供有價值的分子生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究中的宮腔粘連組織和其對照正常組織均取自天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院和天津海濱人民醫(yī)院，取材時間段為2016年1月至2019年3月。所有標(biāo)本的獲取都經(jīng)過患者的知情同意，并且得到倫理道德委員會的批準(zhǔn)。手術(shù)后立即將標(biāo)本置于液氮罐內(nèi)，置于-80℃冰箱，備用。人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(hESC)購自北京中原生物科技有限公司。胰酶購于美國Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于美國Invitrogen 公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清均購于美國Gibco公司；CCK8購于上海碧云天生物有限公司；Transwell小室購自天津萊博公司；實時熒光定量 PCR試劑盒購于南京諾唯贊公司；蛋白裂解液RIPA購于沈陽萬類生物科技有限公司；E-cadherin、ICAM1、Vimentin、α-SMA、COL1A1、DNA損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)節(jié)因子1(DRAM1)和GAPDH抗體購于Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 hESC細(xì)胞在含有10%胎牛血清、0.2% collagenase I、100 U/mL青/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別按照12孔板或者96孔板各5×104/孔、5×103孔的量鋪板，18 h后按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染，分為miR-NC和miR-665 mimics組，按既定的時間做相關(guān)的實驗。

1.2.2 CCK8 檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染0、24、48 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，避光培養(yǎng)4 h后測定OD450值，細(xì)胞活性按照CCK8試劑盒說明書計算并作圖。

1.2.3 集落形成實驗 hESC細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后收集并計數(shù)，按照500個/孔的數(shù)量接種在12孔板內(nèi)，每3 d更換培養(yǎng)基，大約2周后處理細(xì)胞。先用1×PBS清洗一遍，再用結(jié)晶紫染料染色并計數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞遷移實驗 hESC細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將miR-NC和miR-665 mimics組細(xì)胞用無血清的DMEM/F12重懸，各取200 μL加到Transwell小室中，每孔加5×104個hESC細(xì)胞，下室加600 μL含有20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔，48 h后用4%的多聚甲醛室溫固定并用0.1% 結(jié)晶紫染色，各15 min，拭去未遷移的細(xì)胞后拍照并計數(shù)，作圖。

1.2.5 實時熒光定量 PCR檢測miR-665和DRAM1的表達(dá)水平，臨床組織標(biāo)本加液氮研磨后用Trizol法提取總RNAs。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)過48 h后用Trizol法提取總的RNA。用分光光度計檢測RNA的純度。反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以U6為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR分析，實驗步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。實驗中所需的引物序列如下：

miR-665-qPCR-For：5′-TGCGGACCAGGAGGCTGAG-3′; miR-665 Rev:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6-For：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′；DRAM1-qPCR-For：5′-CAGAGGACAGACAGGGTT-3′；DRAM1-qPCR-Rev：5′-AACCAAGGTCTTCCGTAT-3′; β-actin-qPCR-For: 5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′; β-actin-qPCR-Rev: 5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白的表達(dá)量 細(xì)胞收集后用1×PBS洗一遍，加入RIPA裂解液重懸后冰上裂解30 min，中間再混勻一次，4℃、 12 000 r/min的條件離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度定量試劑盒完成濃度檢測。變性后的蛋白用10%的SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃敷過夜，1×TBST洗3遍，每遍10 min；室溫敷二抗1 h，1×TBST洗3遍，每遍10 min，一、二抗均按1∶1 000稀釋。最后滴加發(fā)光液并在暗室曝光。

2 結(jié)果

2.1 miR-665在宮腔粘連患者組織中的表達(dá) miR-665在50例宮腔粘連患者組織中低表達(dá)，其表達(dá)水平與宮腔粘連的惡性程度呈負(fù)相關(guān)(圖1-A、1-B)。另外，我們化學(xué)合成了miR-665模擬物，并在hESC細(xì)胞中驗證miR-665模擬物顯著上調(diào)miR-665的表達(dá)水平(圖1-C)。

注:A: RT-qPCR檢測宮腔正常組織及粘連組織中miR-665的表達(dá)水平；B: RT-qPCR檢測正常組織及不同嚴(yán)重程度的粘連組織中miR-665的表達(dá)水平；C: RT-qPCR檢測miR-665模擬物在hESC細(xì)胞中的有效性；miR-665 mimics: miR-665模擬物;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖1 miR-665在宮腔粘連患者中的表達(dá)水平

2.2 miR-665抑制hESC細(xì)胞的增殖能力和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程 CCK8實驗表明miR-665模擬物能夠顯著抑制hESC的細(xì)胞活性(圖2-A)。集落形成實驗表明miR-665模擬物能夠顯著抑制hESC的細(xì)胞增殖能力(圖2-B)。Transwell遷移實驗表明miR-665模擬物能夠顯著抑制hESC的細(xì)胞遷移能力(圖3)。Western blot實驗表明miR-665模擬物能夠顯著促進(jìn)hESC細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)并抑制ICAM1、Vimentin、α-SMA、COL1A1的表達(dá) (圖4)。

注：A：CCK8檢測miR-665模擬物對hESC細(xì)胞活性的影響；B：集落形成實驗檢測miR-665模擬物對hESC細(xì)胞增殖能力的影響圖2 miR-665模擬物抑制細(xì)胞增殖

圖3 Transwell實驗檢測miR-665模擬物對hESC細(xì)胞遷移能力的影響

注：A：Western blot檢測miR-665模擬物對上皮間質(zhì)化的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；B：Western blot檢測miR-665模擬物對纖維化的相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；*P<0.05，**P<0.01圖4 Western blot檢測miR-665模擬物對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-665能夠直接靶定DRAM1 Targetscan及StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-665能夠直接靶定DRAM1(圖5-A)。我們構(gòu)建了DRAM1的EGFP熒光報告載體，結(jié)果證明miR-665模擬物轉(zhuǎn)染hESC細(xì)胞后能夠降低熒光的強(qiáng)度(圖5-B)。RT-qPCR實驗顯示miR-665模擬物轉(zhuǎn)染hESC細(xì)胞后能夠降低DRAM1的 mRNA水平(圖5-C)。Western blot實驗分析miR-665模擬物轉(zhuǎn)染hESC細(xì)胞后能夠降低DRAM1的蛋白水平(圖5-D)。

注：A: Targetscan及StarBase生物信息學(xué)預(yù)測miR-665的靶定位點;B: EGFP報告載體實驗驗證miR-665與DRAM1的靶定關(guān)系;C: RT-qPCR檢測miR-665模擬物對DRAM1 mRNA水平的影響;D: RT-qPCR檢測miR-665模擬物對DRAM1 蛋白水平的影響;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖5 miR-665直接靶定DRAM1

2.4 miR-665通過調(diào)控DRAM1緩解體內(nèi)宮腔粘連的進(jìn)程 體內(nèi)實驗證明，HE染色顯示miR-665模擬物能夠顯著緩解人工誘導(dǎo)大鼠的宮腔粘連；免疫組化實驗結(jié)果顯示miR-665模擬物能夠降低DRAM1的表達(dá)水平(圖6-A)。RT-qPCR和Western blot實驗證明miR-665組能夠降低組織中DRAM1的mRNA水平和蛋白水平(圖6-B、6-C)。

注：A: 免疫組化染色檢測DRAM1在大鼠宮腔組織的表達(dá)分布;B: RT-qPCR檢測大鼠宮腔組織中DRAM1 mRNA的水平變化;C: Western blot檢測大鼠宮腔組織中DRAM1蛋白的水平變化;D: Western blot檢測轉(zhuǎn)染后hESC細(xì)胞中上皮間質(zhì)化的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;E: Western blot檢測轉(zhuǎn)染后hESC細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;*P<0.05, **P<0.01圖6 miR-665通過DRAM1發(fā)揮作用

2.5 miR-665通過調(diào)控DRAM1發(fā)揮其抑制性作用 Western blot實驗證明DRAM1能夠抑制hESC細(xì)胞E-cadhernin的表達(dá)，促進(jìn)hESC細(xì)胞ICAM1、Vimentin、α-SMA、COL1A1的表達(dá)(圖6-D、6-E)。

2.6 miR-665和DRAM1在宮頸癌患者中的表達(dá)水平 TCGA和OncomiR數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌患者中miR-665是低表達(dá)的(圖7-A、7-B)。K-M軟件分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-665的患者生存率更好(圖7-C)。TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌患者中DRAM1是高表達(dá)的(圖7-D、7-E)。K-M軟件分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)DRAM1的患者生存率不良(圖7-F)。StarBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者中miR-665與DRAM1的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖7-G)。

注：A: TCGA數(shù)據(jù)庫分析miR-665在宮頸癌中水平;B: OncomiR數(shù)據(jù)庫分析miR-665在宮頸癌中水平;C: K-M軟件分析宮頸癌患者的生存曲線;D: TCGA數(shù)據(jù)庫分析DRAM1在宮頸癌中水平;E: GEPIA數(shù)據(jù)庫分析DRAM1在宮頸癌中水平;F: K-M軟件分析宮頸癌患者的生存曲線;G: StarBase數(shù)據(jù)庫分析宮頸癌患者中miR-665與DRAM1的相關(guān)關(guān)系圖7 生物信息學(xué)預(yù)測宮頸癌中miR-665與DRAM1的關(guān)系

3 討論

miRNA是一類小的非編碼的相對保守的RNA，長度為18-25個堿基，通常能夠抑制蛋白的表達(dá)或者降解其靶基因的mRNA。很多證據(jù)證明，miRNA介導(dǎo)的基因的轉(zhuǎn)錄后修飾能夠調(diào)控很多生活學(xué)功能，如炎癥、血管形成、纖維化修復(fù)、凋亡及宮腔粘連[12]。最近的研究報道，miR-665作為一個抑制性的因子能夠失活Wnt/β-catenin信號通路[13]。miR-665能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[14]。我們發(fā)現(xiàn)miR-665在宮腔粘連中低表達(dá)的。過表達(dá)miR-665后，能夠顯著抑制hESC細(xì)胞的增殖能力，遷移能力和EMT進(jìn)程。

DRAM1是一種進(jìn)化上保守的跨膜蛋白，主要定位于溶酶體，并作為腫瘤蛋白p53(TP53)介導(dǎo)的自噬和程序性細(xì)胞死亡的靶點[15]。最近的報道表明，高水平的DRAM1與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者的總生存期較短有關(guān)，而DRAM1的敲低抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSCs)的遷移和侵襲能力[16]。本研究發(fā)現(xiàn)DRAM1過表達(dá)后能促進(jìn)EMT進(jìn)程。另外，我們通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-665在宮頸癌患者中是低表達(dá)的，且與患者生存率呈正相關(guān)。DRAM1在宮頸癌患者中是高表達(dá)的，且與患者生存率呈負(fù)相關(guān)。而且，miR-665與DRAM1的表達(dá)水平在宮頸癌中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-665通過靶定并調(diào)控DRAM1的表達(dá)抑制hESC細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和EMT進(jìn)程。miR-665也能緩解體內(nèi)宮腔粘連的發(fā)生發(fā)展。因此，miR-665將可能作為一種新的策略用于治療宮腔粘連。