鐘周琳 周 燕 盧 芳 李麗蘭 李恒聰 蔣麗紅 陳潔潤(rùn) 吳國(guó)光

(廣西南寧輸血醫(yī)學(xué)研究所，南寧市 530007，電子郵箱：zhzhl2000@126.com)

血小板制品在創(chuàng)傷、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤等患者中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，而通常血小板于(22±2)℃(常溫)振蕩條件下僅能保存5 d，因此臨床常面臨血小板制品短缺的問(wèn)題。此外，與其他血液制品相比，常溫保存的血小板制品的細(xì)菌污染風(fēng)險(xiǎn)更高，而病原體滅活技術(shù)可降低此風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。血小板保存損傷成為解決血小板保存問(wèn)題的瓶頸，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板發(fā)生一系列代謝活動(dòng)，影響血小板質(zhì)量及功能[4]。-80℃冰凍保存可減少血小板的代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)血小板保存時(shí)間，但是凍融過(guò)程可能會(huì)改變血小板構(gòu)象。目前用于檢測(cè)血小板制品質(zhì)量的常規(guī)指標(biāo)僅有血小板計(jì)數(shù)、pH值等。血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)通過(guò)檢測(cè)血栓粘彈力，分析血小板、纖維蛋白、凝血因子等在凝血、纖溶等過(guò)程的相互作用，檢測(cè)原理更接近血小板在人體內(nèi)的生理學(xué)功能。本研究應(yīng)用TEG、流式細(xì)胞術(shù)分析常溫和冰凍保存條件下的單采血小板活化、凋亡以及凝血功能的差異，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 樣本來(lái)源 選取2017年6月至2019年4月南寧中心血站單采血小板16份，獻(xiàn)血者男女比例為1 ∶1，年齡18～55歲，符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》，獻(xiàn)血前5 d內(nèi)未服用抑制或損害血小板功能的藥物(如含阿司匹林或阿司匹林類(lèi)藥物)。應(yīng)用無(wú)菌接管技術(shù)將每份單采血小板樣本分成8份，其中4份于(22±2)℃下振蕩保存在一次性使用血小板常溫保存袋中，分別于采集當(dāng)日、第3天、第5天及第8天進(jìn)行檢測(cè)；另外4份置于凍存管中，加入100 μL終濃度為5%的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)后于-80℃保存，分別于保存第3天、第5天、第8天及1年將樣本置于37℃水浴溶解后進(jìn)行檢測(cè)。獻(xiàn)血者對(duì)本研究知情同意，本研究經(jīng)南寧中心血站倫理委員會(huì)審查同意。

1.2 試劑與儀器 TEG Hemostasis System Kaolin試劑盒(美國(guó)Haemoscope公司，批號(hào)：HMO400、HMO4134)，藻紅蛋白標(biāo)記的CD62P抗體(美國(guó)BD公司，批號(hào)：7135680)，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)(美國(guó)BD公司，批號(hào)：7298795)，一次性使用血小板常溫保存袋(四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司，批號(hào)：170608)，DMSO(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SHBG6226V),多聚甲醛(天津市博迪化工有限公司，批號(hào)20150415)，TEG5000血栓彈力圖儀(美國(guó)Haemoscope公司)，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)， Sysmex XT-2000i五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司)。

1.3 血小板計(jì)數(shù)及平均血小板體積的檢測(cè) 將樣本顛倒混勻后，采用五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)獲得血小板計(jì)數(shù)及平均血小板體積(mean platelet volume，MPV)，操作按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.4 TEG檢測(cè) 將樣本及含高嶺土、混合磷脂等成分的TEG Hemostasis System Kaolin試劑盒分別置于室溫平衡15 min后，取1 000 μL樣本加入試劑盒中，輕輕顛倒混勻5次，吸取330 μL樣本加入含30 μL 0.2 mol/L氯化鈣的TEG上樣杯中，在37 ℃、CK模式下檢測(cè)60 min，記錄凝血時(shí)間、最大振幅、 α角、凝血指數(shù)等數(shù)據(jù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板CD62P表達(dá)水平 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板CD62P表達(dá)水平以評(píng)價(jià)血小板的活化程度。將血小板(106個(gè)細(xì)胞)與10 μL藻紅蛋白標(biāo)記的CD62P抗體混勻后室溫避光孵育15 min，加入1 mL 1%多聚甲醛固定液，充分混勻，2℃～8℃避光放置30 min。24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀獲取10 000個(gè)血小板以分析CD62P表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板磷脂酰絲氨酸暴露水平 血小板凋亡早期磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻至細(xì)胞膜表面，而Annexin V是鈣離子依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，因此采用熒光標(biāo)記的Annexin V通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可檢測(cè)PS的暴露水平，從而評(píng)價(jià)血小板的凋亡情況[5]。將血小板(106個(gè)細(xì)胞)、5 μL FITC-Annexin V、100 μL 1×結(jié)合緩沖液混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液后立即用流式細(xì)胞儀獲取10 000個(gè)血小板以分析Annexin V結(jié)合率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，重復(fù)測(cè)量計(jì)量資料的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 常溫和冰凍保存對(duì)血小板計(jì)數(shù)和MPV的影響 在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的血小板計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=0.024，P組間=0.879)；兩組的血小板計(jì)數(shù)均無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=2.419，P時(shí)間=0.115)；分組與時(shí)間無(wú)交互效應(yīng)(F交互=0.445，P交互=0.582)。兩組的MPV比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=3.445，P組間=0.073)；在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的MPV均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=23.895，P時(shí)間<0.001)；分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=7.770，P交互=0.002)。見(jiàn)表1。

表1 常溫和冰凍保存下血小板制品各指標(biāo)的差異(n=16，x±s )

2.2 常溫和冰凍保存對(duì)TEG相關(guān)指標(biāo)的影響 在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的凝血時(shí)間、凝血指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=251.094、31.763，均P組間<0.001)，各時(shí)點(diǎn)冰凍保存的血小板制品凝血時(shí)間低于常溫保存的血小板制品凝血時(shí)間(P<0.05)，在采集后第5天、第8天時(shí)，冰凍保存的血小板制品凝血指數(shù)高于常溫保存的血小板制品凝血指數(shù)(P<0.05)；兩組的凝血時(shí)間、凝血指數(shù)均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=22.458，P時(shí)間<0.001；P時(shí)間=7.153，P時(shí)間=0.002)；分組與時(shí)間均有交互效應(yīng)(F交互=34.039、15.805，P交互<0.001)。在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的最大振幅、 α角比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=0.355，P組間=0.556；F組間=0.402，P組間=0.531)；兩組的最大振幅有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=8.561，P時(shí)間=0.001)，α角無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=0.974，P時(shí)間=0.383)；最大振幅和α角分組與時(shí)間均無(wú)交互效應(yīng)(F交互=0.743，P交互=0.457；F交互=0.642，P交互=0.530)。見(jiàn)表1。

2.3 常溫和冰凍保存對(duì)血小板CD62P表達(dá)水平的影響 在采集后第3天、第5天、第8天，兩組的血小板CD62P表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=24.877，P組間<0.001)，其中在采集后第5天、第8天時(shí)，冰凍保存的血小板CD62P表達(dá)水平低于常溫保存的血小板CD62P表達(dá)水平(P<0.05)；兩組的血小板CD62P表達(dá)水平均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=172.437，P時(shí)間<0.001)；分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=89.653，P交互<0.001)。見(jiàn)表1。

2.4 常溫和冰凍保存對(duì)血小板PS暴露水平的影響兩組的血小板Annexin V結(jié)合率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=144.471，P組間<0.001)，其中在采集后第3天、第5天、第8天時(shí)冰凍保存的血小板Annexin V結(jié)合率高于常溫保存的血小板Annexin V結(jié)合率(P<0.05)；兩組的血小板Annexin V結(jié)合率均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(F時(shí)間=221.275，P時(shí)間<0.001)；分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=25.781，P交互<0.001)。見(jiàn)表1。

3 討 論

常溫[(22±2)℃]振蕩保存的血小板可吸收血液保存液中的葡萄糖，通過(guò)透氣性血袋與外界交換氣體，完成有限的能量代謝。然而，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，血小板發(fā)生不同程度的活化、凋亡，導(dǎo)致血小板出現(xiàn)損傷。另外，常溫保存增加了細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的輸血不良反應(yīng)[6-7]。盡管低溫保存的血小板發(fā)生分子結(jié)構(gòu)和形態(tài)上的改變，但是其保存期長(zhǎng)，可緩解血小板制品供應(yīng)緊張的問(wèn)題[8-11]。血小板的低溫保存可分為冷藏保存(2℃～6℃)和冰凍保存(-80℃)，其中冰凍保存血小板的應(yīng)用更為廣泛。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已認(rèn)可DMSO作為冰凍血小板的保護(hù)劑，荷蘭也在軍隊(duì)中應(yīng)用冰凍血小板進(jìn)行輸血治療[8,12]。

本研究結(jié)果顯示，兩組的血小板計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組的血小板計(jì)數(shù)均無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(P>0.05)，分組與時(shí)間無(wú)交互效應(yīng)(P>0.05)；兩組的MPV比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩組的MPV均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(P<0.05)，分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(P<0.05)，提示兩種保存方法對(duì)血小板體積都有影響，但差異不大。在采集后第3天、第5天、第8天，冰凍保存的血小板制品凝血時(shí)間低于常溫保存的血小板制品(P<0.05)；同時(shí)兩組的凝血時(shí)間均有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(P<0.05)，其中常溫保存的血小板制品的凝血時(shí)間隨保存時(shí)間的推移而升高，即血小板制品中的凝血因子逐漸失活，然而冰凍保存的血小板制品的凝血時(shí)間隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而縮短，凝血活性增強(qiáng)，這與常溫保存的血小板的變化趨勢(shì)相反。此外，采集后第3天、第5天、第8天時(shí)，兩組血小板Annexin V結(jié)合率均隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而升高，其中在各時(shí)點(diǎn)冰凍保存的血小板Annexin V結(jié)合率均高于常溫保存的血小板(P<0.05)，提示冰凍保存過(guò)程中血小板PS高度暴露。而PS是一種促凝因子，可與凝血因子X(jué)a結(jié)合使凝血酶生成增加，促進(jìn)血液凝塊的形成[13]，這可能是冰凍血小板凝血時(shí)間縮短的原因。此外，冰凍保存過(guò)程中血小板PS的高度暴露可能會(huì)導(dǎo)致血小板輸入人體后很快被清除出循環(huán)系統(tǒng)，而如何延長(zhǎng)冰凍血小板在體內(nèi)存活時(shí)間，避免被快速清除，仍需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究以探討[14-15]。

最大振幅、α角是反映血小板功能的主要TEG指標(biāo)，本研究中兩組的最大振幅、 α角比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組的最大振幅有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(P<0.05)，α角無(wú)隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(P>0.05)；分組與時(shí)間均無(wú)交互效應(yīng)(P>0.05)，提示隨著時(shí)間的推移，最大振幅均發(fā)生變化，但兩種保存方法差異不大。凝血指數(shù)可反映血液總體凝血情況，本研究中在采集后第5天、第8天，冰凍保存的血小板凝血指數(shù)均高于常溫保存的血小板(P<0.05)，其中在采集后第8天時(shí)常溫保存的血小板凝血指數(shù)<-3.0，提示處于低凝狀態(tài)，而冰凍保存1年后凝血指數(shù)仍在正常水平(正常值范圍：-3～3)，顯示了冰凍保存保存時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)越性。此外，采集后各時(shí)點(diǎn)，兩組血小板CD62P表達(dá)水平均隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而升高，其中在保存第5天、第8天時(shí)冰凍保存的血小板CD62P表達(dá)水平低于常溫保存的血小板CD62P表達(dá)水平(P<0.05)，提示血小板制品隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生明顯活化，而冰凍保存的血小板活化程度低于常溫保存，因此冰凍保存對(duì)血小板制品的長(zhǎng)期保存更具有優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，與常溫保存的單采血小板相比，冰凍保存的單采血小板制品PS暴露水平更高、凝血活性更強(qiáng)，具有更穩(wěn)定的凝血功能，可用于治療因創(chuàng)傷等需要即刻止血的患者；且保存期更長(zhǎng)，可作為常溫保存血小板制品的補(bǔ)充，以緩解血小板保存期短的難題。