賈軍皓,曹 丁,陳勉華,趙培靜,明飛平,梁倩怡,李嘉怡,樊 欽,鄧錦波,張淑霞,馬苗鵬,張玲華,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642;2.廣州工業(yè)微生物檢測(cè)中心,廣東廣州 510663)

在肉類(lèi)食品的養(yǎng)殖中抗生素作為非營(yíng)養(yǎng)性促生長(zhǎng)劑被廣泛應(yīng)用,長(zhǎng)期的使用和濫用造成了嚴(yán)重的后果,如廣譜及交叉耐藥性,導(dǎo)致肉類(lèi)食品中抗生素殘留以及肉食類(lèi)畜禽免疫機(jī)能的嚴(yán)重下降等[1]。另外,在食品加工和生產(chǎn)過(guò)程中為了延長(zhǎng)食品的貨架期,通常添加防腐劑抑制微生物。然而現(xiàn)在市場(chǎng)上主要以化學(xué)防腐劑為主,具有不環(huán)保,毒性大等缺點(diǎn)[2]。這些問(wèn)題日趨嚴(yán)重,嚴(yán)重威脅著食品安全和人類(lèi)健康。尤其是近年來(lái)“超級(jí)細(xì)菌”逐漸增多,加之農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃2017-2020》,2020年全面禁止在正常養(yǎng)殖過(guò)程中使用抗生素[3]?！妒称饭I(yè)“十三五”發(fā)展規(guī)劃》中明確提出:加快發(fā)展功能性食品添加劑,鼓勵(lì)和支持天然防腐劑;重點(diǎn)利用生物工程技術(shù)和生物發(fā)酵制品的技術(shù)提高提取物質(zhì)量[4]。因此,尋找和生產(chǎn)這種高效和安全的天然抑菌劑迫在眉睫。

抗菌肽是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類(lèi)內(nèi)源性小分子肽類(lèi)物質(zhì),是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)天然免疫的重要成分,抗菌肽種類(lèi)繁多,抗菌譜廣,殺傷力強(qiáng),對(duì)某些耐藥性病原菌也有很強(qiáng)的滅菌作用,是抗生素的最佳替代品之一[5]。菌絲霉素(Plectasin)是一種真菌抗菌肽,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性致病菌有很好的殺傷性,且能在重組菌中高效表達(dá)[6]。目前菌絲霉素主要通過(guò)以下3種途徑獲得:直接從生物體內(nèi)分離純化;人工化學(xué)合成;基因工程進(jìn)行重組菌的表達(dá)。其中,直接提取難度較大,化學(xué)合成成本太高,規(guī)模化生產(chǎn)難度較大[6]。在現(xiàn)有的重組菌中的表達(dá)產(chǎn)量較低,且不是自誘導(dǎo)表達(dá)型[7]。將菌絲霉素的來(lái)源拓展到具有廣闊開(kāi)發(fā)前景的酪丁酸梭菌中,加上強(qiáng)啟動(dòng)子后從中高水平表達(dá)提取菌絲霉素獲得成功,將大幅降低菌絲霉素等抗菌肽的研發(fā)和生產(chǎn)成本,從而加速這類(lèi)新型抗菌生物制品的開(kāi)發(fā)和在食品加工和生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[8],具有重要意義。

酪丁酸梭菌,又名丁酸梭菌,是一種專(zhuān)性厭氧、革蘭氏陽(yáng)性的梭狀芽孢桿菌,主要存在于動(dòng)物糞便、土壤環(huán)境中。最早于1933年由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)抑制作用。謝樹(shù)貴等[9-10]的研究發(fā)現(xiàn),酪丁酸梭菌對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的具有明顯的拮抗作用。在共同培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用十分強(qiáng)烈[9]。另外,研究表明,酪丁酸梭菌能使上調(diào)IL-18的基因表達(dá)并促使產(chǎn)生IL-18蛋白[11]。這種促進(jìn)IL-18的基因表達(dá)作用無(wú)論在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或體外上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中都得到證實(shí)[12],且有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù),是表達(dá)和分泌外源蛋白的重要模式菌株。使用強(qiáng)并可控的啟動(dòng)子是高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。加上強(qiáng)啟動(dòng)子的重組菌可以超高水平表達(dá)菌絲霉素蛋白,其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他重組菌,并且還能夠直接用于制備安全的具有抑菌功能的益生菌制劑,對(duì)金黃色葡萄球菌,化膿鏈球菌,無(wú)乳鏈球菌,糞腸球菌等抑菌作用明顯[13]。本研究獲得了高效表達(dá)菌絲霉素的酪丁酸梭菌重組菌。因?yàn)槔叶∷崴缶菄?yán)格的益生菌厭氧菌,且含有芽孢[14],作為抑菌食品添加劑,不僅防止食物腐爛,對(duì)食用者腸道免疫功能也很有益[15]。所得的菌劑可替代部分抗生素,為綠色,安全食品生產(chǎn),提供更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

載體pMTL82151 由華南理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王菊芳教授團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng);酪丁酸梭菌(ClostridiumtyrobutyricumATCC 25755) 購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保藏中心;受試菌 金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923),由本實(shí)驗(yàn)室保存;菌絲霉素標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自廣州德為生物科技有限公司;LB液體培養(yǎng)基 10 g/L蛋白胨,5 g/L酵母提取物,10 g/L氯化鈉,pH7.0;LB固體培養(yǎng)基 對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中加入1.2% 瓊脂粉;RCM液體培養(yǎng)基 梭菌增殖培養(yǎng)基38 g/L,溶于雙蒸水中,pH7.0;RCM固體培養(yǎng)基 對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中加入1.2%瓊脂粉;液體和固體培養(yǎng)基 均在121 ℃,20 min條件下高溫濕熱滅菌。

電泳系統(tǒng) XCell SureLock? Mini-Cell蛋白垂直電泳槽(北京瑞茂宏達(dá)科技有限公司美國(guó)生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 本研究中使用的引物均由Primer5.0設(shè)計(jì),并由廣州擎科生物有限公司合成。名稱(chēng)與序列如表1所示:

表1 本研究使用的引物 Table 1 Primers used in this study

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建方案 本實(shí)驗(yàn)中所使用的表達(dá)用質(zhì)粒載體為pMTL82151,首先將Pthl克隆到載體pMTL82151上,得到質(zhì)粒pMTL82151-thl,然后再將產(chǎn)菌絲霉素基因Pt克隆到Pthl的下游,得到Pt基因表達(dá)質(zhì)粒pMTL82151-Pt,如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction

1.2.3 質(zhì)粒pMTL82151-thl的構(gòu)建 先使用thl-XbaI-F/R擴(kuò)增,然后以其擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,利用thl-F/R繼續(xù)擴(kuò)增,得到thl基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR程序:98 ℃預(yù)變性2 min,變性(98 ℃,10 s)、退火(55 ℃,30 s)、延伸(68 ℃,20 s)三個(gè)步驟循環(huán)30次,最后65 ℃延伸2 min,PCR體系見(jiàn)表2。將thl基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pMTL82151進(jìn)行雙酶切,用XbaⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化,并回收酶切產(chǎn)物。將thl基因與質(zhì)粒pMTL82151連接,得到質(zhì)粒pMTL82151-thl。將反應(yīng)體系置于恒溫金屬浴中16 ℃恒溫反應(yīng)過(guò)夜;然后進(jìn)行大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化,取出感受態(tài)細(xì)胞,冰浴5 min,待其融化后,將連接產(chǎn)物全部加入感受態(tài)細(xì)胞中,輕柔混勻;冰浴30 min,42 ℃水浴熱激90 s,立刻置于冰浴8 min;加入900 μL新鮮的LB培養(yǎng)基,37 ℃溫和震蕩培養(yǎng)45 min～1 h;4000 r/min離心5 min,吸棄上清900 μL,剩下的液體與沉淀輕柔混勻;均勻涂布到有抗生素的篩選平板上,倒置培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)陽(yáng)性克隆菌株送去北京擎科生物科技公司測(cè)序鑒定,并用質(zhì)粒通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定所得到的陽(yáng)性克隆重組菌,電泳檢測(cè)菌落PCR鑒定結(jié)果。

1.2.4 菌絲霉素Pt基因克隆 根據(jù)Zasloff等[16]的研究,從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上下載得到Pt基因,根據(jù)酪丁酸梭菌對(duì)密碼子偏愛(ài)性?xún)?yōu)化基因,然后設(shè)計(jì)4條引物合成,先使用Pt 2,3擴(kuò)增,然后以其擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,利用Pt 1,4繼續(xù)擴(kuò)增。PCR程序:98 ℃預(yù)變性2 min,變性(98 ℃,10 s)、退火(55 ℃,30 s)、延伸(68 ℃,20 s)三個(gè)步驟循環(huán)30次,最后65 ℃延伸2 min。PCR體系見(jiàn)表2。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

1.2.5 酪丁酸梭菌C.tyrobutyricum/pMTL82151-Pt的構(gòu)建 將按照1.2.4中方法獲得的Pt基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pMTL82151-thl進(jìn)行雙酶切,分別用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化,并回收酶切產(chǎn)物。將Pt基因與質(zhì)粒pMTL82151-thl連接,得到質(zhì)粒pMTL82151-Pt。進(jìn)行大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化,對(duì)陽(yáng)性克隆菌株送北京擎科生物科技公司去測(cè)序鑒定,并用質(zhì)粒通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定所得到的陽(yáng)性克隆。向5 mL RCM液體培養(yǎng)基中接種酪丁酸梭菌,37 ℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜,向5 mL LB 液體培養(yǎng)基中(30 μg/mL氯霉素),接種含質(zhì)粒pMTL8-Pt的大腸桿菌CA434,37 ℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜;待大腸桿菌CA434的OD600值約為1.5時(shí),4000 r/min離心2 min;去上清,加入1 mL PBS溶液懸浮沉淀,4000 r/min離心2 min,重復(fù)該步驟一次;加入200 μL PBS溶液懸浮沉淀,加入200 μL生長(zhǎng)到OD600值約為1.5的酪丁酸梭菌混勻;混合物涂布RCM平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)過(guò)夜;用1 mL PBS溶液吹打收集平板上的菌體,涂布到含有30 μg/mL甲砜霉素的RCM篩選平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)2～3 d;挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳,確定陽(yáng)性克隆,送測(cè)序并保存菌種(即突變株)。

1.2.6Pt基因在酪丁酸梭菌中的發(fā)酵表達(dá) 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于含20 mL RCM(含30 μg/mL甲砜霉素)培養(yǎng)基的試管中,30 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)24 h。將20 mL菌液轉(zhuǎn)移至200 mL RCM培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng),共培養(yǎng)96 h。

1.2.7Pt組成型表達(dá)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定 蛋白電泳:以濃度為300 μg/mL的菌絲霉素蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,取100 μL 1.2.6中發(fā)酵的發(fā)酵液上清溶液于小試管中,用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,濾液用于SDS-PAGE電泳測(cè)定蛋白表達(dá)水平,10%分離膠,5%濃縮膠。樣品處理:2×加樣緩沖液按1∶1稀釋蛋白質(zhì)樣品溶液,于100 ℃煮沸3～5 min。上樣:取處理后的樣品加入樣品池中,并加入20 μL低分子量蛋白Marker作對(duì)照。電泳:樣品在堆積膠階段電壓為80 V,在分離膠階段電壓調(diào)整為120 V,2.5 h。染色:將膠從玻璃板中取出,置于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色,室溫4～6 h。脫色:將膠從染色液中取出,放入脫色液中,多次脫色至蛋白帶清晰。發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定:以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為實(shí)驗(yàn)菌株,將金黃色葡萄球菌懸浮液(OD600nm=0.5～0.6)50 μL與46 ℃的LB固體培養(yǎng)基100 mL混勻后鋪平板,待其凝固后4 ℃保存,用無(wú)菌打孔器打孔,每孔中滴加待測(cè)培養(yǎng)發(fā)酵液上清(發(fā)酵0、24、48、72、96 h)5 μL,待孔中液體被培養(yǎng)基吸收完全后,上述平板37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜(10～12 h)以同體積的無(wú)菌水培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照,氨芐青霉素(Amp)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0和Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)值均用(mean±sd)表示,采用單因素方差分析,用于多組間或兩兩比較,P>0.05為無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用ImageJ圖像處理軟件,對(duì)SDS-PAGE圖像結(jié)果估算出重組轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵液上清中的最終表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建與鑒定

用質(zhì)粒通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定所得到的陽(yáng)性克隆。電泳檢測(cè)菌落PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。圖3顯示得到約510 bp的基因片段,與預(yù)期大小510 bp相符。因此所得陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確,通過(guò)PCR方法獲得編碼菌絲霉素蛋白的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,在142 bp附近得到目的條帶,與預(yù)期大小相符(圖4)。挑取抗性平板上的多拷貝轉(zhuǎn)化子,30 ℃、220 r/min,振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,離心收集菌體提取重組質(zhì)粒,并且對(duì)重組質(zhì)粒酶切,結(jié)果如圖5所示:PCR鑒定所得到編碼重組蛋白菌絲霉素Pt基因序列與預(yù)期一致,即所挑取重組子呈陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

圖2 質(zhì)粒pMTL82151-thl菌落PCR鑒定電泳檢測(cè)Fig.2 Plasmid pMTL82151-thl colony PCR identification electrophoresis detection注:泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1～10為質(zhì)粒pMTL82151-thl的大腸桿菌CA434陽(yáng)性克隆株。

圖3 PCR擴(kuò)增thl基因電泳分析Fig.3 PCR amplification of thl gene electrophoresis注:泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1為thl基因條帶。

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.4 PCR amplification product注:M:DNA Marker DL2000,1:Pt。

圖5 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物Fig.5 Recombinant plasmid digestion product注:M:DNA Marker DL5000,1,2:重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。

2.2 Pt在酪丁酸梭菌中表達(dá)

將上述PCR鑒定呈陽(yáng)性的重組轉(zhuǎn)化子接種于含200 mL RCM(含30 μg/mL甲砜霉素),30 ℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)96 h后,離心收集發(fā)酵液上清。發(fā)酵液上清的SDS-PAGE結(jié)果表明,重組轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)上清在4.4 kDa處均有一明顯的蛋白條帶(圖6),通過(guò)對(duì)SDS-PAGE上的蛋白條帶用ImageJ估算軟件計(jì)算出重組轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵液上清中的最終平均表達(dá)量為260.12 μg/mL(表3)。與PT的理論分子量一致。瓊脂孔穴擴(kuò)散法測(cè)定重組轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清中菌絲霉素的抗菌活性如圖7所示,使用Origin擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IC50為12.74 μg/mL(表4),重組轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液上清中菌絲霉素對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 25923具有明顯的抑制作用。

圖6 發(fā)酵后酪丁酸梭菌重組表達(dá)菌絲霉素的發(fā)酵液電泳液Fig.6 Fermentation solution electrophoresis solution of Clostridium butyricum recombinantly expressing mycelia after induction注:M:Marker,1～5:重組菌發(fā)酵液上清中菌絲霉素,分別是2、2.5、3、3.5、4 μL；6～7:菌絲霉素標(biāo)準(zhǔn)品,分別是2、3 μL。

表3 發(fā)酵液上清的SDS-PAGE使用ImageJ估算分析Table 3 SDS-PAGE estimation of fermentation broth supernatant by ImageJ

圖7 酪丁酸梭菌重組表達(dá)菌株的發(fā)酵液抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of fermentation broth of Clostridium tyrobutyricum pMTL82151-Pt

表4 梯度濃度發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制分析Table 4 Inhibition analysis of gradient concentration fermentation broth on Staphylococcus aureus

3 討論

本研究成功構(gòu)建了一株酪丁酸梭菌表達(dá)菌絲霉素的工程菌,且在在菌絲霉素基因前加上強(qiáng)啟動(dòng)子thl,很大程度上提高了菌絲霉素在工程菌中的產(chǎn)量,相比于Xiong等[17]的研究,Lima等將含有菌絲霉素NZ2114與親水性卷曲蛋白聚合物CP4融合體在畢赤酵母中分泌表達(dá),制備完整的NZ2114-CP4聚合共聚物。他們雖然純化的NZ2114-CP4具有抗菌活性,IC50為33.56 μg/mL,其活性較低,而本研究中重組菌發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲霉素IC50為12.74 μg/mL,具有較高的抗菌活性。Cai等[18]將菌絲霉素蛋白與小泛素樣修飾子(SUMO)融合在枯草芽孢桿菌中表達(dá),麥芽糖利用操縱子Pglv誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白SUMO-plectasin。通過(guò)Ni-NTA樹(shù)脂柱純化并通過(guò)SUMO蛋白酶消化,最終蛋白表達(dá)量為0.14 g/L,而本研究為0.25 g/L。且Cai等[18]報(bào)道需要麥芽糖誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌的表達(dá),這樣無(wú)法直接使用在動(dòng)物腸道內(nèi)定植表達(dá)。本研究中所用的工程菌菌株,酪丁酸梭菌在腸道定植繁殖生長(zhǎng)時(shí)的主要代謝產(chǎn)物為丁酸。丁酸可以作為小腸黏膜的主要能量來(lái)源,是腸道上皮組織細(xì)胞再生和修復(fù)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),對(duì)小腸的絨毛的修復(fù)起著重要的作用。且酪丁酸梭菌能影響動(dòng)物腸道內(nèi)菌群的豐度、多樣性以及組成[19-20]?，F(xiàn)已證實(shí),酪丁酸梭菌能增加腸道群落中乳酸桿菌屬和Faecalibaculum等有益菌群的物種豐度,降低韋榮球菌屬(Erysipelotrichaceae)等致病菌的物種豐度,具有調(diào)節(jié)腸道菌群,平衡腸道微生態(tài)的作用[21]。本研究已經(jīng)成功在酪丁酸梭菌中高水平表達(dá)菌絲霉素蛋白,與其他工程菌株對(duì)比,腸道有益菌酪丁酸梭菌的優(yōu)勢(shì)在于定植在腸道且表達(dá)菌絲霉素。

菌絲霉素在食品加工領(lǐng)域具有很強(qiáng)的潛在價(jià)值,菌絲霉素對(duì)人畜無(wú)害,可以直接做成食品抑菌添加劑,有非常廣闊的應(yīng)用前景[22]。通過(guò)酪丁酸梭菌表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵表達(dá)菌絲霉素,重組菌發(fā)酵72 h后的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率為68.74%,且IC50為12.74 μg/mL,該發(fā)酵培養(yǎng)簡(jiǎn)單,周期短,成本低。為日后的規(guī)模化大生產(chǎn)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ);也促使菌絲霉素成為新型天然食品添加劑[23],有力地保障食品加工和生產(chǎn)的安全。同時(shí)也為肉食類(lèi)畜牧養(yǎng)殖中抗生素替代品[24]提供了更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。