孫齊英 夏明

摘要：在大白菜貯藏和運(yùn)輸期間極易受真菌、細(xì)菌等微生物侵染而導(dǎo)致軟腐病，鑒定軟腐病的病原菌是防治大白菜軟腐病的重要前提。對武漢市洪山區(qū)白沙洲蔬菜市場大白菜軟腐病進(jìn)行病原鑒定。從大白菜軟腐病病部分離并培養(yǎng)病原物，并進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化鑒定、回接試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)及基因測序。結(jié)果表明，大白菜軟腐病的病原菌菌株S3菌落為灰白色，圓形，中部稍隆起，邊緣呈半透明狀;菌體為桿菌，革蘭氏陰性菌;不產(chǎn)酸，不能分解色氨酸、產(chǎn)生吲哚，甲基紅（M.R.）試驗(yàn)為陰性，乙酰甲基甲醇（V.P.）試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)H2S，容易從傷口侵入。與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）細(xì)菌的16S rDNA序列的一致性為99.40%，說明該病原為假單胞菌屬。

關(guān)鍵詞：大白菜;16S rDNA;軟腐病;病原菌;假單胞菌屬;鑒定

中圖分類號(hào)： S436.341.13 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）15-0141-03

受副熱帶高壓控制，湖北武漢夏季呈現(xiàn)出氣溫高、濕度大、時(shí)間長等特點(diǎn)，加上大白菜在運(yùn)輸途中由于擠壓、碰撞形成傷口，極易在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生大面積軟腐病，損失極大，嚴(yán)重影響大白菜市場供應(yīng)[1]。一般認(rèn)為，大白菜軟腐病病原菌是胡蘿卜軟腐歐式桿菌（Erwinia carotovora var.carotovora）[2-4]。本研究從武漢市蔬菜批發(fā)市場成功分離出大白菜軟腐病的病原菌，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)以及分子鑒定，確定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），與前人報(bào)道的大白菜軟腐病病原菌為胡蘿卜軟腐歐式桿菌不同，這為大白菜軟腐病防治提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受檢作物 當(dāng)季的黃心大白菜（來自武漢市洪山區(qū)白沙洲農(nóng)副產(chǎn)品大市場，產(chǎn)地多為湖北省周邊城市及海南?。?，分別挑選健康和已經(jīng)腐爛的葉球若干。

1.1.2 主要試劑 試驗(yàn)主要試劑有LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基（1 L）、LB液體培養(yǎng)基（1 L）、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（1 L）、硫酸亞鐵瓊脂培養(yǎng)基（SIM培養(yǎng)基）、蛋白胨水培養(yǎng)基（1 L）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer、5×TBE、溴化乙錠（EB）染劑、草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅染液。

1.1.3 主要儀器 試驗(yàn)主要儀器有高壓滅菌鍋、光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、搖床、生化培養(yǎng)箱、氣候培養(yǎng)箱、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大白菜軟腐病的癥狀肉眼觀察試驗(yàn) 肉眼觀察大白菜軟腐病的病狀和病癥，觀察發(fā)病部位。

1.2.2 病原菌的分離與純培養(yǎng) 取腐爛的大白菜組織沖洗10 min，瀝干水分，將大白菜組織切成小塊，乙醇浸泡30 s，沖洗2～3次，加入0.1%次氯酸溶液浸泡10 min，沖洗2～3次，加入50 mL無菌水，用滴管抽打制成含有菌體的懸濁液。取1 mL細(xì)菌溶液用無菌水稀釋并涂布在LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃ 避光培養(yǎng)2～3 d。再挑選優(yōu)勢菌落在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃避光培養(yǎng)24～48 h，重復(fù)劃線操作直至得到單菌落，觀察其菌落形態(tài)。

1.2.3 病原菌的回接試驗(yàn) 將獲得的3株單菌落（S1、S2、S3）接種到LB液體培養(yǎng)基并置于28 ℃、140 r/min 的搖床中避光培養(yǎng)16～24 h，離心收集細(xì)菌，用無菌水配制成3×108 CFU/mL懸浮液。

取健康的大白菜葉片，將葉柄部分切成4 cm×4 cm方形小塊，放入燒杯中，加75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，用0.1%次氯酸溶液浸泡 10 min，無菌水沖洗2～3次。無菌紙吸干水分，參照Hu等的方法[5]接種3種單菌落菌液，再將其分別置于空培養(yǎng)皿（墊有濾紙）中，無菌水接種作為對照。培養(yǎng)皿用封口膜密封，置于28 ℃、80%濕度氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況。

1.2.4 病原菌的致病性鑒定 選取有致病作用的S3，按“1.2.3”的方法制成3×108 CFU/mL細(xì)菌懸浮液。用注射器取0.5 mL液體噴灑健康的大白菜葉柄表面（形成懸浮滴為宜）進(jìn)行離體接種試驗(yàn)。

試驗(yàn)分5個(gè)處理：不劃傷口，取0.5 mL LB液體培養(yǎng)基直接噴灑葉柄表面，光照條件下培養(yǎng)（處理1）;葉柄劃長約1 cm、深3 mm傷口，LB液體培養(yǎng)基噴灑葉柄傷口表面，光照條件下培養(yǎng)（處理2）;不劃傷口，取0.5 mL S3液體培養(yǎng)基直接噴灑葉柄表面，光照條件下培養(yǎng)（處理3）;劃傷口，S3液體培養(yǎng)基噴灑葉柄傷口表面，光照條件下培養(yǎng)（處理4）;劃傷口，S3液體培養(yǎng)基噴灑葉柄傷口表面，黑暗條件下培養(yǎng)（處理5）。28 ℃保濕培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況。

1.2.5 病原菌的形態(tài)觀察及生理生化鑒定

1.2.5.1 革蘭氏染色反應(yīng)和形態(tài)觀察 參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行病原菌的革蘭氏染色和形態(tài)觀察。將獲得的S3單菌落在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大化培養(yǎng)，置于28 ℃、140 r/min的搖床中避光培養(yǎng)16～24 h。用滴管吸取菌液，經(jīng)草酸銨結(jié)晶紫染液初染，乙醇脫色，番紅染液復(fù)染后于100倍油鏡下觀察形態(tài)。

1.2.5.2 生理生化鑒定 對S3菌株進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定項(xiàng)目包括H2S試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)（伏-普試驗(yàn)）、M.R.試驗(yàn)（甲基紅試驗(yàn)）、吲哚試驗(yàn)，具體方法參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[7]。

1.2.6 16S rDNA鑒定 將純化后的菌株接種在LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃下培養(yǎng)16～24 h，離心，收集菌體，提取細(xì)菌基因組，得到DNA模板，通過16S rDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并觀察結(jié)果，將條帶單一的PCR樣品送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技公司進(jìn)行測序，隨后將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行序列比對以確定致病菌。PCR體系：由dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×buffer、Mg2+混合成的2×Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，剩余用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)循環(huán)25次;72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜軟腐病的癥狀肉眼觀察結(jié)果

肉眼觀察到大白菜軟腐病的癥狀為受到侵染的植物組織最初成半透明水漬狀，隨著病斑的不斷擴(kuò)大造成葉球中心靠近莖基部大面積軟腐，并且散發(fā)惡臭。病斑為黃褐色，表皮完整，撕破表皮有黃褐色黏液流出（圖1）。

2.2 病原菌的分離與菌落觀察結(jié)果

從病組織中分離純化培養(yǎng)出3種類型的菌落：S1菌落，形態(tài)為淺黃色，圓形，光下成半透明狀;S2菌落，形態(tài)為白色圓形，光下成半透明狀;S3菌落，形態(tài)為灰白色圓形，比S2略大，光下中心部分稍隆起不透明，周圍半透明（圖2）。

2.3 病原菌的回接試驗(yàn)結(jié)果

回接試驗(yàn)結(jié)果顯示，從病組織分理出的S3接種健康的大白菜小塊培養(yǎng)1 d后，接種處出現(xiàn)明顯的水漬狀病斑，并逐步向外擴(kuò)散;2 d后癥狀加重，病斑變?yōu)樯詈稚砥づc內(nèi)部組織分離;7 d后，整個(gè)大白菜小塊皺縮成黑色小塊。S1、S2、對照在培養(yǎng) 7 d 后除接種處出現(xiàn)黑黃色愈合傷疤，其他正常。說明S3引起大白菜健康組織明顯軟腐病變，與肉眼觀察的大白菜軟腐病的典型癥狀相同，可以初步斷定S3為病原菌。

2.4 病原菌的致病性鑒定結(jié)果

由圖3可以看出，處理4發(fā)病狀況最為嚴(yán)重，2 d 病組織出現(xiàn)明顯黃褐色，葉肉和表皮組織分離現(xiàn)象，變得不透明，4 d全部腐爛壞死，7 d植物組織崩潰。處理3直到4 d才出現(xiàn)黃褐色，發(fā)生病變的程度比處理4明顯要輕，處理1、2整個(gè)試驗(yàn)期沒有病變。說明大白菜軟腐病病菌的容易從傷口侵入。

圖3中e為處理4、5接種5 d后發(fā)病情況的癥狀對比，可以看出，處理5在第5天組織完全倒塌，縮成黑色小塊，發(fā)病程度明顯比處理4嚴(yán)重。說明病原菌在光照條件下致病力比黑暗條件下更強(qiáng)。

2.5 S3菌株的生理生化鑒定與形態(tài)觀察結(jié)果

從S3菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，甲基紅試驗(yàn)（M.R.）為陰性，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V.P.）為陰性，吲哚試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)H2S。S3為革蘭氏陰性菌，油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該菌為短桿狀，長度為0.625～1.25 μm，有微弱額運(yùn)動(dòng)性（圖4），符合植物病原細(xì)菌假單胞菌屬（Pseudomonas）形態(tài)和生理生化特征[2]。

2.6 病原菌的PCR鑒定

通過對S3菌株的16S rDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增得到單一條帶并進(jìn)行測序，該序列在NCBI上進(jìn)行比對分析以初步鑒定目標(biāo)菌株。測序結(jié)果表明，S3菌株與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）細(xì)菌的16S rDNA序列的一致性為99.40%，推斷S3菌株為假單胞菌屬細(xì)菌。

3 討論與結(jié)論

本研究通過對武漢蔬菜市場的大白菜軟腐病的致病菌進(jìn)行分離并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定及致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該病原物與假單胞桿菌的特征一致，16S rDNA的測序結(jié)果進(jìn)一步顯示該菌與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）細(xì)菌的16S rDNA序列的一致性為99.40%，因此可以認(rèn)定引起大白菜軟腐病的S3菌株為假單胞屬細(xì)菌。一般認(rèn)為，假單胞屬細(xì)菌主要導(dǎo)致植物葉枯型、葉斑型或青枯型病害，而軟腐型病害主要由胡蘿卜軟腐歐式桿菌引起[2]，但也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，假單胞桿菌屬可以導(dǎo)致植物軟腐病，如格氏假單孢菌（P. grimontii）引起蝴蝶蘭軟腐病[2]， 惡臭假單孢菌（P. putida）引起番茄軟腐病[8]，熒光假單孢菌（P. fluorescens）引起黃瓜莖軟腐病，邊緣假單孢菌（P. marginalis）可以引起馬鈴薯莖塊[9]、馬蹄蓮[10]、百合[11]等軟腐病，邊緣假單孢菌和白枯病假單孢菌引起蔥屬植物葉片軟腐病[12]，假單孢菌屬細(xì)菌引起魔芋軟腐病[13]。本研究也說明胡蘿卜軟腐歐式桿菌不是引起軟腐病的唯一原因。

一般認(rèn)為，從自然孔口侵入的植物病原細(xì)菌更容易從傷口侵入[2]， 本試驗(yàn)也證實(shí)假單胞桿菌可以從自然孔口侵入，但更容易從傷口侵入，2 d即可發(fā)病，其發(fā)病迅速，建議在大白菜運(yùn)輸和貯藏的過程中要盡量避免因擠壓、碰撞等造成傷口。

軟腐病是由于細(xì)菌分解果膠酶裂解植物細(xì)胞中膠層引起，胡蘿卜軟腐歐式桿菌可以產(chǎn)生果膠酶導(dǎo)致軟腐[14]，假單胞桿菌一般產(chǎn)生植物毒素導(dǎo)致壞死[2]，其引起軟腐的致病機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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